New England Biolabs, M0253S, transcriptasa inversa M-MuLV

La transcriptasa inversa M-MuLV sintetiza una cadena de ADN complementaria a partir de un cebador utilizando ARN (síntesis de ADNc) o ADN monocatenario como plantilla. Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc),, RT-PCR y síntesis de ADNc, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 10 minutos a 37 °C utilizando poli(rA) - oligo(dT) como cebador de plantilla con 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 6 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol, 0,5 mM [3H]-dTTP y 0,4 mM poli(rA) - oligo(dT)12-18. Condiciones de reacción Tampón de reacción de transcriptasa inversa M-MuLV 1X Incubar a 42 °C Tampón de reacción de transcriptasa inversa M-MuLV 50 mM Tris-HCl 75 mM KCl 3 mM MgCl2 10 mM DTT (pH 8,3 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM Tris-HCl 150 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % NP-40 pH 7,6 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Peso molecular Teórico: 78000 daltons Preguntas frecuentes P: ¿Se puede usar la transcriptasa inversa M-MuLV en otros NEBuffers? R: La actividad óptima se observa en su tampón único. NEBuffer 2 proporciona alrededor del 50 % de actividad. La actividad óptima se observa a una concentración de Mg2+ de 3 mM. A 10 mM de Mg2+, la actividad cae al 60%. El óptimo de sal es estrecho alrededor de 75 mM (1). (1) Gerard GF y D' Alessio JM, Capítulo 6 (73-93) De: Métodos en Biología Molecular, Vol. 16: Enzimas de Biología Molecular Editado por: MM Burell 1993 Humana Press Inc. Totowa, NJ P: ¿La transcriptasa inversa M-MuLV requiere DTT? R: Sí (1). (1) Gerard GF y D' Alessio JM, Capítulo 6 (73-93) De: Métodos en Biología Molecular, Vol. 16: Enzimas de Biología Molecular Editado por: MM Burell 1993 Humana Press Inc. Totowa, NJ P: ¿Puede la transcriptasa inversa M-MuLV transcribir a través de las uniones ARN-ADN? R: Sí. La transcriptasa inversa M-MuLV puede transcribir a través de la unión ARN-ADN. P: ¿Cómo se puede aumentar la longitud del producto generado por la transcriptasa inversa M-MuLV? R: La incubación a 42 °C puede relajar parte de la estructura secundaria del ARN, lo que permite que la transcriptasa inversa M-MuLV produzca productos más largos. P: ¿Cómo se puede mejorar el rendimiento al utilizar la transcriptasa inversa M-MuLV? R: Evitar la contaminación por ribonucleasa es fundamental, ya que se requiere un ARN molde de alta calidad. El kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript (NEB n.° E6500) incluye un inhibidor de la ARNasa. P: ¿Cuáles son algunas de las razones por las que la reacción de la transcriptasa inversa M-MuLV falla? R: El SDS, el DMSO, un alto contenido de sal o el EDTA en la preparación del molde de ácido nucleico pueden inhibir la reacción. La transcriptasa inversa M-MuLV es especialmente sensible a los efectos quelantes del EDTA, ya que la concentración óptima de Mg₂₄ es de 3 mM. Otras técnicas de biología molecular suelen utilizar 10 mM de Mg2+, por lo que toleran mejor las trazas de EDTA. P: ¿La transcriptasa inversa M-MuLV es activa a temperaturas superiores a 42 °C? R: Para plantillas difíciles específicas (p. ej., con alto contenido de GC o estructura secundaria significativa), se puede utilizar una temperatura de reacción más alta, pero el rendimiento general del ADN puede disminuir. Hemos copiado con éxito mensajes de 6 kb mediante transcripción inversa a 55 °C. P: ¿Se puede utilizar el ADN como plantilla para la transcriptasa inversa M-MuLV? R: Sí, pero la reacción es menos eficiente (1). (1) Gerard GF y D' Alessio JM, Capítulo 6 (73-93) De: Métodos en biología molecular, vol. 16: Enzimas de biología molecular Editado por: MM Burell 1993 Humana Press Inc. Totowa, NJ P: ¿Las ADN polimerasas NEB se suministran con los dNTP? R: No, los dNTP se deben pedir por separado. Se pueden solicitar como una mezcla conveniente (mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.° N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (conjunto de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.° N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido).