New England Biolabs, M0254L, ADN polimerasa Vent®

Categorías relacionadas con la ventilación Otras aplicaciones de las polimerasas PCR PCR de rutina,, Especificación de PCR Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Condiciones de reacción 1X Tampón de reacción ThermoPol® 1X Tampón de reacción ThermoPol® 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1% Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 0,1% Triton® X-100 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular Teórico: 89000 daltons 3' - 5' Exonucleasa Sí Desplazamiento de cadena + Unidad Condiciones del ensayo 1X Tampón ThermoPol, 200 µM de cada dNTP, incluido [3H]-dTTP, 15 nM cebado ADN M13. Tasa de error < 57x10 -6 bases Preguntas frecuentes P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Vent en otros tampones? R: No se recomienda sustituir otros tampones. P: ¿Cuándo se debe usar la ADN polimerasa Vent® para PCR? R: La ADN polimerasa Vent® es una opción ideal y probada para PCR de rutina rentable donde se necesitan productos de alta fidelidad. P: La ADN polimerasa Vent y la ADN polimerasa Deep Vent producen extremos romos de ADN, pero mi clonación depende de que el producto de extensión del cebador tenga un saliente 3' de una sola base de adenina. R: Trate sus productos de extremos romos con ADN polimerasa Taq (NEB #M0267, NEB #M0273). Después de la extensión del cebador con ADN polimerasa Vent, extraiga con fenol:cloroformo y precipite el ADN con 2 volúmenes de isopropanol. Resuspenda en tampón de reacción ThermoPol 1X, agregue 1 unidad de ADN polimerasa Taq y 200 µM de dATP; mezclar bien e incubar a 72 °C durante 20 minutos. P: No puedo hacer que la ADN polimerasa Vent funcione, pero la ADN polimerasa Taq funciona bien. R: Las ADN polimerasas que poseen alta fidelidad debido a una fracción de exonucleasa de corrección son más exigentes en su uso que sus exoderivados o las ADN polimerasas sin una exonucleasa de corrección, como la ADN polimerasa Taq. Además, las diferencias en el Km (ADN) que poseen diferentes ADN polimerasas pueden cambiar la temperatura efectiva de hibridación del cebador. Sugerimos revisar las pautas generales que acompañan a la polimerasa y adherirse a las siguientes sugerencias: 1. Usar el tampón suministrado con la polimerasa. 2. Usar los cuatro dNTP estándar (no dUTP ni dITP). 3. Algunos proveedores de dNTP venden stocks contaminados con dUTP que causarán problemas con nuestras ADN polimerasas termoestables. Para evitar la contaminación, sugerimos dNTP NEB. 4. Optimice la temperatura de annealing para el par de primers. 5. Optimice el nivel de magnesio (2, 4, 6 u 8 mM). 6. Optimice la cantidad de polimerasa (0.25-2 unidades por reacción para correctores; 2-4 unidades por reacción para exo-formas); aumente o disminuya la escala según el volumen de reacción. Los detalles sobre los protocolos de optimización se pueden encontrar en la página general de Referencia Técnica de la Polimerasa. P: ¿Los fragmentos de ADN producidos por la ADN Polimerasa Vent son romos o tienen el saliente 3' de una sola base que produce la ADN Polimerasa Taq? R: La ADN Polimerasa Vent genera > 95% de fragmentos romos. Los exo-derivados son más como la ADN Polimerasa Taq en que hay predominantemente dos tipos de extremos observados; el 70% son romos, mientras que el 30% son predominantemente salientes 3' de una sola base. P: ¿Puedo usar la ADN Polimerasa Vent para pulir los extremos de los fragmentos de ADN? R: Sí, se pueden usar ADN polimerasas con actividad de corrección (exonucleasa 3'→5') para rellenar un saliente 5' y eliminar una extensión 3'. Se prefiere la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210), ya que funciona a 25 °C, se puede usar en diversos tampones y se puede eliminar por calor. P: Quiero clonar productos de extensión de cebadores elaborados con ADN polimerasa Vent o ADN polimerasa Deep Vent. ¿Hay protocolos mejores que otros? R: Los mejores protocolos se basan en la clonación de extremos romos en un vector tratado con fosfatasa. El inserto debe estar quinasado en sus extremos 5', a menos que el cebador se haya sintetizado con un fosfato 5'.