New England Biolabs, M0257S, ADN polimerasa Vent® (exo-)

Categorías relacionadas con la ventilación Otras aplicaciones de las polimerasas PCR PCR de rutina,, Especificación de PCR Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Condiciones de reacción 1X Tampón de reacción ThermoPol® 1X Tampón de reacción ThermoPol® 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 0,1 % Triton® X-100 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación térmica No Peso molecular Teórico: 89000 daltons Exonucleasa 5' - 3' No Exonucleasa 3' - 5' No Desplazamiento de hebra +++ Unidad Condiciones del ensayo 1X Tampón de reacción ThermoPol, 200 µM de cada dNTP, incluido [ 3 H]-dTTP, ADN M13 cebado a 15 nM. Tasa de error < 190x10⁻¹ bases. Preguntas frecuentes : P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Vent (exo) en otros tampones? R: No se recomienda sustituir otros tampones. P: ¿Los fragmentos de ADN producidos por la ADN polimerasa Vent (exo) tienen extremos romos o presentan el saliente 3' de una sola base que produce la ADN polimerasa Taq? R: Se observan predominantemente dos tipos de extremos: el 70 % son romos, mientras que el 30 % son predominantemente salientes 3' de una sola base. Si se desean fragmentos con más del 95 % de extremos romos, utilice una ADN polimerasa correctora como la ADN polimerasa Vent (NEB# M0254). P: No consigo que la ADN polimerasa Vent (exo) funcione, pero la ADN polimerasa Taq funciona bien. A: Las ADN polimerasas que poseen alta fidelidad debido a una fracción de exonucleasa de corrección son más exigentes en su uso que sus derivados exo o ADN polimerasas sin una exonucleasa de corrección, como la Taq ADN polimerasa. Además, las diferencias en el Km (ADN) que poseen diferentes ADN polimerasas pueden cambiar la temperatura efectiva de annealing del cebador. Sugerimos revisar las pautas generales que acompañan a la polimerasa y adherirse a las siguientes sugerencias: 1. Use el tampón proporcionado con la polimerasa. 2. Use los cuatro dNTP estándar (no dUTP o dITP). 3. Algunos proveedores de dNTP venden stocks contaminados con dUTP que causarán problemas con nuestras ADN polimerasas termoestables. Para evitar la contaminación, sugerimos dNTP NEB. 4. Optimice la temperatura de annealing para el par de cebadores. 5. Optimice el nivel de magnesio (2, 4, 6 u 8 mM). 6. Optimice la cantidad de polimerasa (1-2 unidades por 100 μl de reacción para correctores; 2-4 unidades por 100 μl de reacción para exoformas); aumente o disminuya la escala según el volumen de reacción. Puede encontrar detalles sobre los protocolos de optimización en la pestaña de protocolos. P: ¿Qué debo tener en cuenta al diseñar un conjunto de cebadores de PCR? R: 1. Evite la complementariedad entre los cebadores para prevenir la formación de dímeros de cebadores. 2. Evite las repeticiones invertidas (autocomplementariedad). 3. El contenido de GC del cebador debe ser de alrededor del 50 %. 4. Evite las G y C en el extremo 3' de los cebadores. Hay muchos programas informáticos que le ayudarán a diseñar un par de cebadores, como Primer3. P: ¿Cómo puedo facilitar la amplificación de plantillas con estructuras de horquilla o alto contenido de GC? R: La ADN polimerasa OneTaq® (NEB# M0480, NEB# M0481) se ha desarrollado con un tampón GC y un potenciador de alta GC que facilita la amplificación de moldes difíciles. La ADN polimerasa Q5® de alta fidelidad se suministra con tampones y un potenciador de alta GC, y se ha optimizado para una amplificación robusta, independientemente del contenido de GC. También puede probar 7-deaza-dGTP junto con dGTP normal para desestabilizar estructuras difíciles. Nota: El 7-deaza-dGTP atenúa la señal de tinción con bromuro de etidio. OneTaq® y Q5® son marcas registradas de New England Biolabs, Inc.