New England Biolabs, M0258S, ADN polimerasa Deep Vent®

Categorías relacionadas Otras aplicaciones de las polimerasas PCR PCR de rutina,, Especificación de PCR Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Condiciones de reacción 1X Tampón de reacción ThermoPol® 1X Tampón de reacción ThermoPol® 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % Triton® X-100 pH 7,4 a 25 °C Inactivación térmica No Peso molecular Teórico: 89000 daltons Exonucleasa 5' - 3' No Exonucleasa 3' - 5' Sí Desplazamiento de cadena ++ Unidad Condiciones del ensayo 1X Tampón de reacción ThermoPol, 200 µM de cada dNTP, incluido [ 3 H]-dTTP y ADN M13 cebado a 15 nM. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Deep Vent en otros tampones? R: No se recomienda sustituir otros tampones. P: No puedo conseguir que la ADN polimerasa Deep Vent funcione, pero la ADN polimerasa Taq funciona bien. R: Las ADN polimerasas que poseen alta fidelidad debido a una fracción de exonucleasa de corrección son más exigentes en su uso que sus exoderivados o las ADN polimerasas sin una exonucleasa de corrección, como la ADN polimerasa Taq. Además, las diferencias en la Km (ADN) que poseen diferentes ADN polimerasas pueden cambiar la temperatura efectiva de hibridación del cebador. Sugerimos revisar las directrices generales que acompañan a la polimerasa y adherirse a las siguientes sugerencias: 1. Use el tampón suministrado con la polimerasa. 2. Use los cuatro dNTP estándar (no dUTP ni dITP). 3. Algunos proveedores de dNTP venden stocks contaminados con dUTP que causarán problemas con nuestras ADN polimerasas termoestables. Para evitar la contaminación, sugerimos dNTP NEB. 4. Optimice la temperatura de annealing para el primer. 5. Optimice el nivel de magnesio (2, 4, 6, u 8 mM). 6. Optimice la cantidad de polimerasa (0,25-2 unidades por reacción para correctores; 2-4 unidades por reacción para exo-formas); aumente o disminuya la escala según el volumen de reacción. Los detalles sobre los protocolos de optimización se pueden encontrar en la página general de Referencia técnica de la polimerasa. P: ¿Los fragmentos de ADN producidos por la ADN polimerasa Deep Vent son romos en los extremos o tienen el saliente 3' de una sola base que produce la ADN polimerasa Taq? R: La ADN polimerasa Deep Vent genera > 95% de fragmentos romos en los extremos. Los exo- derivados son más como la ADN polimerasa Taq en que se observan predominantemente dos tipos de extremos; El 70 % son romos, mientras que el 30 % son predominantemente salientes 3' de una sola base. P: ¿Puedo usar la ADN polimerasa Deep Vent para pulir los extremos de los fragmentos de ADN? R: Sí, las ADN polimerasas con actividad de corrección (exonucleasa 3'→5') se pueden usar para rellenar un saliente 5' y eliminar una extensión 3'. Se prefiere la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) porque funciona a 25 °C, se puede usar en una variedad de tampones y se puede matar por calor. P: Quiero clonar productos de extensión de cebadores hechos con la ADN polimerasa Vent o la ADN polimerasa Deep Vent. ¿Hay algunos protocolos mejores que otros? R: Los mejores protocolos dependen de la clonación de extremos romos en un vector tratado con fosfatasa. El inserto debe quinasarse en sus extremos 5' a menos que el cebador se haya sintetizado con un fosfato 5'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Vent® (NEB# M0254) o la ADN polimerasa Deep Vent® (NEB# M0258) para crear extremos romos en productos de extensión de cebadores elaborados con la ADN polimerasa Taq (NEB# M0267)? R: Sí. Extraiga el ADN con fenol:cloroformo y precipite el ADN con 2 volúmenes de isopropanol. Resuspéndalo en tampón de reacción ThermoPol 1X, añada 1 o 2 unidades de ADN polimerasa Vent o Deep Vent por cada 100 µl de reacción y 200 µM de dNTP; mezcle bien e incube a 72 °C durante 20 minutos.