New England Biolabs, M0263L, exonucleasa T7

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 nmol de desoxirribonucleótido soluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 30 minutos a 37 °C en 1X NEBuffer 4 con 0,15 mM de dúplex sonicado [3H]-ADN. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 4 Incubar a 25 °C 1X NEBuffer™ 4 50 mM de acetato de potasio 20 mM de Tris-acetato 10 mM de acetato de magnesio 1 mM de DTT (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en NEBuffers Tampón de almacenamiento 10 mM de Tris-HCl 5 mM de DTT 0,1 mM de EDTA 50 % de glicerol pH 8 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿En qué se diferencia la exonucleasa T7 de la exonucleasa Lambda (NEB n.º M0262)? R: La exonucleasa T7 tiene incluso menos actividad en el ADN monocatenario que la exonucleasa Lambda, actúa en las mellas a diferencia de la exonucleasa Lambda y es menos procesiva. Dado que es menos procesiva, puede ser más útil para deleciones anidadas unidireccionales. La enzima se puede diluir para controlar la velocidad de reacción. Con una enzima altamente procesiva, como Lambda Exonuclease, la dilución da una mezcla de productos completamente digeridos y sustrato sin digerir. P: ¿En qué se diferencia T7 Exonuclease de Exonuclease III (NEB# M0206)? R: Exonuclease III actúa en la dirección 3' a 5', opuesta a la de T7 Exonuclease y Lambda Exonuclease. P: ¿Cuál es la actividad de T7 Exonuclease en los NEBuffers? R: NEBuffer 1: 30% NEBuffer 2: 25% NEBuffer 3: 1% NEBuffer 4: 100% P: ¿Puede T7 Exonuclease ser inactivada por calor? R: No. P: ¿Cuál es la mejor manera de generar parciales usando T7 Exonuclease? R: La enzima debe titularse al sustrato. Se sugiere la dilución seriada del ADN incubado durante un tiempo específico. Comience con una incubación de 30 minutos. La incubación a temperatura ambiente puede utilizarse para ralentizar la reacción. Si el ADN es limitante, la enzima puede diluirse en el tampón de reacción para su uso inmediato. P: ¿Se puede despuntar el ADN utilizando la exonucleasa T7? R: No. Utilice el fragmento grande de ADN polimerasa I (Klenow) (NEB n.º M0210) para rellenar los salientes de 5' (también llamados extremos rebajados de 3') y masticar los salientes de 3' o utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB n.º M0250) para masticar los salientes de 3' o 5'. Nota: Los salientes de 3' no se pueden rellenar. P: ¿Funcionará la exonucleasa T7 en el tampón rCutSmart? R: Sí, la exonucleasa T7 funcionará en el tampón rCutSmart. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®. P: ¿Se puede usar la Exonucleasa I con una exonucleasa bicatenaria para purificar preparaciones de plásmidos? R: La Exonucleasa I se puede usar con la Exonucleasa Lambda (NEB# M0262) para purificar preparaciones de plásmidos. La Exonucleasa III (NEB# M0206) y la Exonucleasa T7 (NEB# M0263) también funcionan, pero dañan los plásmidos mellados. Aunque se puede usar la Exonucleasa I, recomendamos usar la Exonucleasa V (RecBCD) (NEB #M0345) para eliminar el ADN cromosómico después de la preparación del plásmido (consulte nuestra Nota de Aplicación: Uso de la Exonucleasa V (RecBCD) para eliminar el ADN genómico residual al purificar plásmidos de bajo número de copias con el Kit Monarch® Plasmid Miniprep).