New England Biolabs, M0269L, ADN polimerasa phi29

Perfecto para amplificación por desplazamiento múltiple Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de hebra Amplificación del genoma completo y amplificación por desplazamiento múltiple, Amplificación isotérmica Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 0,5 pmol de dNTP en material insoluble en ácido en 10 minutos a 30 °C. Condiciones de reacción Suplemento de tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 1X con albúmina recombinante, grado de biología molecular Incubar a 30 °C Tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 1X Tris-HCl 50 mM MgCl2 10 mM (NH4)2SO4 10 mM DTT 4 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % Tween® 20 al 0,5 % IGEPAL® CA-630 pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Peso molecular Teórico: 67000 daltons 5' - 3' Exonucleasa No 3' - 5' Exonucleasa Sí Desplazamiento de hebra ++++ Unidad Condiciones de ensayo Tampón de reacción de la ADN polimerasa phi29 1X, 0,1 mg/ml de albúmina recombinante, 0,01 mg/ml de ADN λ digerido con HindIII, 0,2 µM de dTTP incluyendo [3H]-dTTP, 0,2 mM de dGTP, 0,2 mM de dATP y 0,2 mM de dCTP. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa phi29 en otros NEBuffers? R: Sí. La ADN polimerasa Phi29 tiene una actividad del 30 % en el NEBuffer 1, del 35 % en el NEBuffer 2, del 25 % en el NEBuffer 3, del 90 % en el NEBuffer 4 y del 30 % en el ThermoPol Buffer. También tiene una actividad del 100 % en el tampón rCutSmart con la adición de 4 mM de DTT (concentración final). P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa phi29 para hacer que el ADN se vuelva romo? R: Produce fragmentos con extremos romos durante la síntesis de ADN, por lo que, en teoría, podría usarse para hacer que el ADN se vuelva romo. Tradicionalmente, se utilizan la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) o la ADN polimerasa T4 (NEB# M0203) para hacer que el ADN se vuelva romo. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa phi29 para rellenar los salientes 3'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3'. Para crear extremos romos, se deben eliminar los salientes 3'. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) o la ADN polimerasa T4 (NEB# M0203) son las mejores opciones para eliminar los salientes 3'. La nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) también se puede usar para eliminar los salientes 3'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa phi29 para eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. Utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) para eliminar los salientes 5'. P: ¿Se puede inactivar la ADN polimerasa phi29 por calor? R: Sí, calentando a 65 °C durante 10 minutos. P: ¿A qué velocidad añade nucleótidos la ADN polimerasa phi29 a una plantilla monocatenaria cebada? R: Las siguientes son las velocidades de la ADN polimerasa phi29 a diferentes temperaturas utilizando una plantilla M13 monocatenaria cebada (1): 2280 nt/min a 30 °C; 1490 nt/min a 15 °C; 290 nt/min a 4 °C (1) Soengas, MS, Gutierrez, MS y Salas, M. 1995 J. Mol. Biol.253(4):517-529. P: ¿Funcionará la ADN polimerasa phi29 en el tampón rCutSmart? R: Sí, la ADN polimerasa phi29 funcionará en el tampón rCutSmart. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el proceso de clonación, consulte la tabla "Actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®". P: ¿Se suministran las ADN polimerasas NEB con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden pedir como una mezcla práctica (Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.° N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (Conjunto de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.° N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido).