New England Biolabs, M0275M, ADN polimerasa Bst, fragmento grande

Este producto está disponible en formato sin glicerol. Categorías relacionadas: Amplificación isotérmica y desplazamiento de cadena. Aplicaciones: Amplificación del genoma completo, Amplificación isotérmica mediada por bucle, Especificación de amplificación isotérmica . Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 65 °C. Condiciones de reacción 1X ThermoPol® Reaction Buffer Incubar a 65 °C 1X ThermoPol® Reaction Buffer 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton® X-100 (pH 8,8 a 25 °C) Actividad en NEBuffers Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % Triton® X-100 pH 7,1 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Peso molecular Teórico: 67000 daltons 5' - 3' Exonucleasa No 3' - 5' Exonucleasa No Desplazamiento de cadena ++++ Unidad Condiciones de ensayo 50 10 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM de MgCl₂, 30 nM de ADN SS M13mp18, 70 nM de cebador de secuenciación M13 (–47) de 24 mer, 200 µM de dATP, 200 µM de dCTP, 200 µM de dGTP, 100 µM de dTTP, incluyendo [₃H]-dTTP, y 100 µg/ml de BSA. Preguntas frecuentes : P: ¿Se suministran las ADN polimerasas NEB con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden solicitar como una mezcla conveniente (mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.º N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (conjunto de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.º N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido). P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst en otros NEBuffers, incluido rCutSmart? R: Se observa una actividad óptima en el tampón de reacción ThermoPol (200 % de actividad). La unidad se analiza en un tampón no óptimo tomado de la bibliografía. La enzima exhibe una actividad del 50% en los tampones NE 1 y 3, y del 100% en los tampones 2 y 4. Los tampones NE 1-4 deben suplementarse con 0,1% de Triton X-100 o 100 µg/ml de albúmina recombinante para alcanzar estos valores. También puede usarse en el tampón rCutsmart. Para ver su % de actividad funcional en rCutsmart y la de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst para hacer que el ADN se vuelva romo? R: Los salientes 5' (extremos 3' rebajados) pueden rellenarse, pero los salientes 3' no se eliminarán porque la enzima carece de actividad exonucleasa. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) es la enzima de elección para esta aplicación. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst para rellenar los salientes 3'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3'. Para crear extremos romos, se deben eliminar los salientes 3'. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210), la ADN polimerasa T4 (NEB# M0203) o la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) son las mejores opciones para eliminar los salientes 3'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst para eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. Utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) para eliminar los salientes 5'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst para la secuenciación por ciclo térmico? R: No, las temperaturas de reacción son demasiado altas para la estabilidad de la enzima. P: ¿Puede la ADN polimerasa Bst iniciarse en una muesca en el ADN? R: Sí, puede iniciar la síntesis de la cadena en una muesca utilizando el extremo 3' OH como cebador. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst en reacciones de marcaje y de relleno parcial? R: Sí, el fragmento Klenow (3'→5' exo-) (NEB# M0212) también se recomienda para estas aplicaciones. P: ¿Se puede diluir la ADN polimerasa Bst? R: Sí, se puede diluir y almacenar en un tampón que contenga 0,1 % de Triton X-100 o 100 μg/ml de BSA. El tampón recomendado es 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0,1 % de Triton X-100 y 50 % de glicerol. También se puede utilizar el diluyente A (NEB# B8001S). P: ¿Puede usarse la Bst ADN polimerasa a temperaturas diferentes de 65 °C? R: Sí, la enzima tiene las siguientes actividades: 10-15 % a 37 °C 30-45 % a 50 °C 100 % a 60-65 °C 20 % a 70 °C No se recomienda a temperaturas superiores a 70 °C porque se inactiva con el calor. P: ¿Tiene la Bst ADN polimerasa una exonucleasa de corrección 3'→5' activa? R: No. P: ¿La Bst ADN polimerasa, fragmento grande, incorpora dUTP? R: Sí, pero con una inhibición significativa cuando el dUTP reemplaza >50 % del dTTP en la reacción. Para reacciones con dUTP recomendamos una mezcla <50:50 de dUTP y dTTP o el uso de la Bst 2.0® ADN polimerasa (M0537). P: ¿Tiene la Bst ADN polimerasa actividad de transcriptasa inversa? R: Sí, pero suele ser demasiado baja para su uso en aplicaciones de transcripción inversa. Ciertos conjuntos de cebadores y dianas pueden usarse con Bst como polimerasa RT/ADN de enzima única, pero recomendamos usar una transcriptasa inversa específica. Si se desea una polimerasa única, Bst 2.0® tiene una actividad de transcriptasa inversa significativamente mayor y debe usarse en lugar de la ADN polimerasa Bst LF. P: ¿Dispone NEB de una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP proporcionados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP funcionando como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande, Bst 2.0, Bst 3.0 y la ADN polimerasa Bst-XT? R: Las cuatro polimerasas son ADN polimerasas moderadamente termoestables con actividad de desplazamiento de cadena, lo que les permite realizar reacciones de amplificación isotérmica como LAMP. La ADN polimerasa Bst 2.0 es un homólogo diseñado in silico de la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande. Está diseñada para mejorar las propiedades en las reacciones LAMP, incluyendo la tolerancia a la sal, la termoestabilidad y la incorporación de dUTP. La Bst 2.0 destaca por su alta especificidad. La Bst 3.0 ofrece algunas mejoras, entre las que destaca una mayor velocidad de amplificación. La Bst 3.0 también ha mejorado su rendimiento en reacciones LAMP a temperaturas más altas (hasta 72 °C); sin embargo, para algunos objetivos, la Bst 3.0 no conserva la alta especificidad de la Bst 2.0. Bst-XT combina las propiedades más deseables de Bst 2.0 y Bst 3.0. Ofrece la alta especificidad de Bst 2.0 y la rápida velocidad de amplificación de Bst 3.0. Bst-XT también es activo en un rango de temperatura más amplio, lo que permite reacciones LAMP entre 50 y 70 °C. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 Velocidad de amplificación ★★★★★ ★★★★ ★★★★★ Especificidad ★★★★★ ★★★★★ ★★ ¿Configuración a temperatura ambiente? Habilitado Habilitado No recomendado Temperatura óptima de LAMP 50-70 °C 60-70 °C 55-72 °C Disponible sin glicerol Sí NEB #M9205 Sí NEB #M0402 Sí NEB #M0443 ★★★★★ = producto óptimo recomendado para la aplicación seleccionada ★★ o ★★★ = funcionará en la aplicación seleccionada ★ = puede funcionar pero no se recomienda P: ¿Cuáles son las principales causas de falla de reacción al usar Bst ADN polimerasa? R: Las temperaturas superiores a 70 °C pueden reducir significativamente la actividad enzimática o no usar el tampón apropiado que contenga 0,1 % de Triton X -100 o 100 μg/ml de BSA. Consulte la pregunta 1 anterior. P: ¿Cuándo debería ser la Bst ADN polimerasa la enzima de elección? R: La Bst ADN polimerasa es buena en el desplazamiento de hebras. Cubre un vacío entre las polimerasas termófilas y mesófilas. La temperatura óptima de 60-65 °C es superior a la de la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB #M0210) e inferior a la de la ADN polimerasa Vent® (NEB #M0254), otras dos polimerasas con desplazamiento de cadena. Esto ofrece a los investigadores un rango más amplio de condiciones de reacción para optimizar el desplazamiento de cadena y la hibridación de cebadores. Esto resulta útil en el diseño de estrategias de secuenciación, así como en tecnologías de amplificación isotérmica. La elevada temperatura de reacción facilita la secuenciación a través de regiones ricas en GC. Selección de NEB de productos basados ​​en la ADN polimerasa Bst para la amplificación isotérmica de ADN ACTIVIDAD EXO de 5′ a 3′ VELOCIDAD DE AMPLIFICACIÓN CONFIGURACIÓN A TEMPERATURA AMBIENTE ACTIVIDAD DE LA TRANSCRIPTASA INVERSA TOLERANCIA A INHIBIDORES APLICACIONES ADN polimerasa Bst, longitud completa ** N/AN/AN/A * Reacciones de traducción de mellas a temperaturas elevadas ADN polimerasa Bst, fragmento grande N/A * N/A * * Reacciones generales de desplazamiento de cadena, polimerasa original para LAMP y otras amplificaciones diagnósticas ADN polimerasa Bst 2.0 N/A ** N/A ** ** LAMP mejorada, SDA y otras reacciones de amplificación ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart N/A ** *** ** ** Ensayos de amplificación consistentes, a temperatura ambiente y de alto rendimiento ADN polimerasa Bst 3.0 N/A *** ** *** *** Reacciones LAMP y RT-LAMP más rápidas y robustas. Alta actividad de transcriptasa inversa hasta 72 °C *** Producto óptimo y recomendado para la aplicación seleccionada ** Funciona bien para la aplicación seleccionada * Funcionará en la aplicación seleccionada, pero no se recomienda N/D No aplicable a esta aplicación