New England Biolabs, M0276S, E. coli Poli(A) Polimerasa

La poli(A) polimerasa cataliza la adición independiente de plantilla de AMP desde ATP al extremo 3' del ARN Categorías relacionadas Modificación de ARN, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Aplicaciones Especificación de PCR Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de AMP en ARN en un volumen de 20 μl en 10 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción de polimerasa poli(A) suplementado con 1 mM de ATP Incubar a 37 °C 1X tampón de reacción de polimerasa poli(A) 50 mM Tris-HCl 250 mM NaCl 10 mM MgCl2 (pH 8,1 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 1 mM EDTA 50 % glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 7,5 a 25 °C Condiciones de ensayo de la unidad 1X tampón de reacción de polimerasa poli(A), 1 mM de rATP y 500 ng de ARN poli A de 20 mer marcado con 5' FAM en una reacción de 20 μl. Después de la incubación a 37 °C durante 10 minutos, la longitud de la adición de poli(A) se determina mediante electroforesis en gel o con un secuenciador capilar de ADN automatizado. En este ensayo, 5 unidades de enzima añaden aproximadamente de 60 a 80 adenosinas al cebador de ARN. En estas condiciones, 20 unidades de enzima agotarán el rATP. Preguntas frecuentes P: ¿Cómo se puede inactivar la poli(A) polimerasa de E. coli sin calentar la reacción? R: La poli(A) polimerasa se puede inactivar añadiendo EDTA a una concentración final de 10 mM al tampón de reacción. P: ¿Funciona la poli(A) polimerasa de E. coli en el tampón de transcriptasa inversa M-MuLV? R: Sí. La poli(A) polimerasa funciona bien en el tampón de transcriptasa inversa M-MuLV. Si lo que se pretende es llevar a cabo el paso de poliadenilación y luego la reacción de RT, recomendamos configurar estas reacciones en dos pasos secuenciales. La reacción de poliadenilación se puede realizar primero utilizando el tampón de transcriptasa inversa, luego se pueden agregar los componentes adicionales de la RT para llevar a cabo la reacción de transcripción inversa. P: ¿Puede la E. coli Poli(A) Polimerasa usarse para agregar una cola de poli A al ssDNA? R: No. La E. coli poli(A) polimerasa no agregará A al ADN monocatenario. Sin embargo, la Transferasa Terminal (M0315) es una ADN polimerasa que agregará una cola de poli dA al extremo 3' del ADN monocatenario utilizando dATP. Tenga en cuenta que la Transferasa Terminal no usará ATP. P: ¿Puede la E. coli Poli(A) Polimerasa también agregar GTP, UTP y CTP al ARN? R: La Poli (A) Polimerasa es muy selectiva para la adición de ATP al extremo 3' del ARN. Sin embargo, la Poli (U) Polimerasa (M0337) agregará los cuatro ribo NTP al ARN. La enzima es más activa con UTP, pero también añadirá otros NTP a velocidades más lentas. Sin embargo, tenga en cuenta que la poli (U) polimerasa puede exhibir cierto sesgo de actividad basado en la secuencia 3' del ARN. En algunos de esos casos, la enzima no añadirá los NTP alternativos eficientemente. P: ¿Puedo marcar el extremo de una molécula de ARN poliadenilado con una base Cy3/5 o modificada con biotina utilizando la poli (A) polimerasa de E. coli? R: Sí. La biotina-ATP puede ser incorporada eficientemente por la poli (A) polimerasa. Las bases modificadas Cy3/5 también pueden incorporarse, pero con una eficiencia menor. La longitud de la cola y la densidad de biotina se pueden controlar optimizando el tiempo de reacción, la relación ATP/biotina-ATP y la concentración total de ATP. P: ¿Funciona la poli (A) polimerasa de E. coli en el ARNt? R: Sí. La poli (A) polimerasa de E. coli funciona en el ARNt siempre que este tenga un extremo 3' libre. P: ¿Se requiere MnCl₂ para una reacción con la poli(A) polimerasa de E. coli? R: La enzima requiere la presencia de un catión divalente para su actividad. En ausencia de MgCl₂, se puede añadir MnCl₂ en una concentración no superior a 1 mM. P: ¿Es posible que la poli(A) polimerasa de E. coli añada la misma longitud de poli A a todas las moléculas de ARN? R: No. La cantidad de As que se añade a un conjunto de moléculas de ARN tiene una distribución gaussiana, por lo que no es posible planificar la adición de una cantidad determinada de A a todas las moléculas de ARN presentes en una reacción. P: ¿Podemos utilizar la mezcla de ribonucleótidos (N0466) para sustituir la adición de una solución de rATP para la cola de poli A de un molde de ARN que utiliza la poli(A) polimerasa de E. coli? R: No se recomienda el uso de la mezcla de rNTP en una reacción de poli(A) polimerasa de E. coli porque los nucleótidos distintos del ATP no serán incorporados por la poli(A) polimerasa y potencialmente pueden inhibir la reacción. Vendemos rATP como un producto separado (P0756S). P: ¿Es la poli(A) polimerasa de E. coli capaz de alargar oligorribonucleótidos cortos e inmovilizados en la superficie? ¿Cuál es la longitud mínima de una secuencia de ARN que puede ser reconocida por la enzima y, por lo tanto, alargada? R: La poli(A) polimerasa de E. coli puede agregar poli As a un oligo de ARN de 20 bases de longitud. No hemos intentado agregar poli A a un oligo de ARN unido. P: ¿Cuál es el peso molecular de la poli(A) polimerasa de E. coli? R: El peso molecular de la poli(A) polimerasa de E. coli es de 54,6 kDa.