New England Biolabs, M0287L, Mezcla maestra LongAmp® Taq 2X

Rendimiento excepcional con amplicones largos Categorías relacionadas ADN polimerasas LongAmp®,, Mezclas maestras Aplicaciones PCR de largo alcance,, PCR especializada,, PCR de rutina, Especificación Mezcla maestra 1X Composición 60 mM Tris-SO4 20 mM (NH4)2SO4 2 mM MgSO4 0,3 mM dNTPs 3% Glicerol 0,06% IGEPAL® CA-630 0,05% Tween® 20 125 unidades/ml ADN polimerasa LongAmp Taq pH 9,1 a 25 °C Inactivación por calor No Exonucleasa 5' - 3' Sí Exonucleasa 3' - 5' Sí Desplazamiento de cadena + Unidad Condiciones del ensayo Tampón de reacción ThermoPol® 1X, 200 µM dNTPs que incluye [3H]-dTTP y 15 nM de ADN M13 cebado. Condiciones de reacción: Mezcla maestra LongAmp Taq 1X, plantilla de ADN y cebadores en un volumen total de reacción de 25–50 μl. Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Preguntas frecuentes : ¿Es el ADNg purificado con Monarch adecuado para la PCR de largo alcance? R: Sí. El gran tamaño de fragmento del ADNg purificado con Monarch lo convierte en un excelente material de partida para PCR de largo alcance. Para PCR de largo alcance, recomendamos la polimerasa LongAmp TaqDNA (NEB n.° M0323), la mezcla maestra LongAmp Taq 2x (NEB n.° M0287) o la polimerasa LongAmp Hot Start Taq (NEB n.° M0534). El ADN genómico purificado con el kit de extracción de ADNg Monarch Spin es de alta calidad y adecuado para aplicaciones sensibles como PCR de largo alcance y qPCR A. Las reacciones de amplificación se configuraron con pares de cebadores específicos para amplicones de 6, 8, 10, 12, 16 y 20 kb de ADN humano. Se utilizó la mezcla maestra LongAmp® Hot Start Taq 2x (NEB n.º M0533) y se añadieron 25 ng de ADN molde a cada muestra. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un termociclador Applied Biosystems 2720. El ADN genómico purificado con Monarch, aislado de células HeLa y sangre humana, se comparó con el ADN de referencia disponible comercialmente de la línea celular humana NA19240 F11. Se cargaron 10 de 20 μl en un gel de agarosa al 1,5 %, utilizando la escalera de ADN de 1 kb (NEB n.º N3232) como marcador. Los resultados indicaron que el ADN era de alta integridad y adecuado para PCR de largo alcance. B. El ADN genómico purificado con Monarch de sangre humana, células HeLa y cola de ratón se diluyó para producir un rango de cinco logaritmos de concentraciones de plantilla de entrada. Los resultados se generaron utilizando cebadores dirigidos a gHEME (sangre humana) y gREL (HeLa, cola de ratón) para ensayos de qPCR con la mezcla maestra Luna Universal qPCR (NEB n.° M3003) y se ciclaron en un termociclador de qPCR Bio-Rad® CFX Touch. Los resultados indicaron que el ADN es altamente puro y libre de inhibidores, óptimo para qPCR. P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad polimerasa intrínseca de Taq añade un extremo 3'A sin plantilla, mientras que la actividad exonucleasa 3'-5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también reduce el brillo de los productos de PCR. Por ello, estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de annealing adecuada para mi reacción? R: La temperatura de annealing óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB tiene en cuenta los componentes del tampón que afectan a las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la temperatura óptima de annealing de la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una temperatura de annealing única (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico entre sustancias químicas y reactantes que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: Esta sección trata específicamente el annealing de un cebador oligonucleotídico a un molde de ADN. Durante la etapa de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten el annealing (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleotídico monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de annealing (TA) es la temperatura utilizada durante el annealing del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la cual el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. Por qué es importante usar la temperatura de annealing correcta para una PCR exitosa La temperatura de annealing de una reacción es usualmente menor que la temperatura de fusión para asegurar la hibridación del cebador con la plantilla. Si la temperatura de annealing es demasiado alta, el cebador no se annealizará con la plantilla y la amplificación no procederá. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión inespecífica del cebador(es) con la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto inespecífico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de hibridación de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con la adenina y la timina (% de contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuantos más enlaces de hidrógeno (mayor Tm) haya de un cebador con su molde, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTP La concentración libre de iones de magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactivos y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTP, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ADNmc) aumenta la concentración de cationes monovalentes (Na+, K+) en el cebador. Los cationes monovalentes contribuyen a la estabilidad del dúplex de ADN, al igual que los iones de magnesio. Los cationes monovalentes y los iones de magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, máximo amplicón, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para obtener más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para obtener más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido incorrectamente emparejado. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para obtener más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, ausencia de amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Le interesa el resultado? Consulte nuestra Guía de Solución de Problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la Optimización de PCR con ADN Polimerasas Termófilas y en esta entrada del blog. El equipo de soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, En condiciones óptimas, suele observarse una mancha o un fondo alto. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima. Reduzca la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la recomendada por el protocolo específico del producto. Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; pruebe con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación. Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos. Si, además de la mancha, se observa un halo iluminado alrededor del pocillo, use menos plantilla.