New England Biolabs, M0289L, Fosfatasa Antártica

La fosfatasa antártica (AnP) es una fosfatasa alcalina termolábil purificada a partir de una fuente recombinante. Categorías relacionadas: Fosfatasas, Aplicaciones de modificación de ARN, Desfosforilación, Clonación de ARN, Especificación, Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que desfosforilará 1 µg de ADN del vector pUC19 cortado con una enzima de restricción, generando extremos 5' retraídos, en 30 minutos a 37 °C. La desfosforilación se define como una inhibición > 95 % de la recircularización en una reacción de autoligación y se mide por transformación en E. coli. Condiciones de reacción Tampón de reacción de fosfatasa antártica 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de fosfatasa antártica 1X Bis-Tris-propano-HCl 50 mM MgCl2 1 mM ZnCl2 0,1 mM (pH 6 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM Glicerol al 50 % ZnCl2 0,01 mM pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 2 minutos Pesos moleculares Aparente: 35 kDa Teórico: 69 kDa Condiciones del ensayo unitario El ADN del vector se desfosforila en tampón de endonucleasa de restricción suplementado con tampón de reacción de fosfatasa antártica. La ligadura se realiza con 50 ng de vector utilizando el kit de ligadura rápida NEB (NEB n.º M2200). Preguntas frecuentes P: ¿Qué fosfatasa alcalina, Quick CIP, rSAP o fosfatasa antártica funciona mejor? R: Quick CIP (NEB n.° M0525) es la mejor opción porque ofrece un protocolo rápido, no requiere aditivos y tiene una alta actividad específica. Se prefiere Quick CIP a la fosfatasa antártica porque no requiere zinc añadido ni ningún otro cofactor en el tampón de reacción. Como resultado, Quick CIP se puede añadir directamente a los digestos de enzimas de restricción. Además, después de la inactivación por calor de esta enzima, no es necesario purificar el ADN del vector antes de la reacción de ligadura. P: El número de colonias que no contienen un inserto parece alto, ¿cómo puedo saber si la fosfatasa antártica funcionó? R: Se pueden utilizar los siguientes controles para diagnosticar este problema: 1. Vector sin cortar para comprobar la viabilidad celular y probar la resistencia a los antibióticos del plásmido. Sembrar en medio y medio más antibiótico. 2. Vector cortado y no ligado para comprobar si hay vector sin cortar. Puede ser necesaria la purificación en gel del vector cortado (recomendamos el kit de extracción de gel de ADN Monarch, NEB n.º T1020) para eliminar el último 0,1 % del vector sin cortar. 3. Vector cortado y ligado: para comprobar la integridad de los extremos y las condiciones de ligadura. 4. Vector cortado, fosfatado y ligado para comprobar la desfosforilación; debe ser del 3 al 5 % del vector cortado y ligado. También deben comprobarse las condiciones de ligadura (consulte las preguntas frecuentes sobre la ADN ligasa T4, NEB n.º M0202). P: ¿Desfosforilan proteínas la Quick CIP, la rSAP o la fosfatasa antártica (AnP)? R: Se puede utilizar Quick CIP, la rSAP o la AnP para desfosforilar proteínas; sin embargo, NEB recomienda utilizar la fosfatasa proteica Lambda (Lambda PP, catálogo NEB n.º P0753), una fosfatasa proteica dual con una especificidad muy amplia. P: ¿Es necesario purificar el ADN después de la digestión de restricción, antes del tratamiento con fosfatasa antártica? R: En la mayoría de los casos, la fosfatasa antártica funciona bien en una reacción que contenga la enzima de restricción, pero solo si se complementa con tampón de reacción de fosfatasa antártica 10X hasta una concentración final de 1X. Si es posible, inactive la enzima de restricción mediante calor. P: ¿Es necesario purificar el ADN después del tratamiento con fosfatasa antártica? R: No. Inactive mediante calor durante 2 minutos a 80 °C o 5 minutos a 70 °C (o según sea necesario para inactivar la enzima de restricción). Si la enzima de restricción no se puede inactivar mediante calor, el ADN debe purificarse antes de la ligadura. P: ¿Cuál es el peso molecular? R: La enzima es de 70 kDa; sin embargo, es un dímero y opera como de 35 kDa. P: ¿Se puede inactivar la fosfatasa antártica por calor? R: Sí. Inactive por calor durante 2 minutos a 80 °C o durante 5 minutos a 70 °C. Alternativamente, caliente según sea necesario para inactivar la enzima de restricción. P: ¿Qué grupos fosfato eliminan la rSAP, la Quick CIP o la fosfatasa antártica (AnP)? R: La rSAP, la Quick CIP y la AnP, como cualquier fosfatasa alcalina, eliminan los fosfatos de los extremos 5' y 3' del ADN y ARN monocatenarios y bicatenarios, y también desfosforilan los dNTP. Las fosfatasas alcalinas (incluidas la rSAP, la Quick CIP y la AnP) no tienen actividad en las estructuras de la tapa 5' del ARN. P: ¿Es necesario purificar el ADN después de una digestión de restricción y antes de... ¿El paso de desfosforilación? R: Si las enzimas utilizadas en la digestión de restricción se pueden inactivar por calor, no se requiere un paso de purificación. Si no se pueden inactivar por calor, se recomienda un paso de limpieza entre la digestión de restricción y el paso de desfosforilación. P: ¿Es necesario purificar el ADN después del paso de desfosforilación y antes del paso de ligación? R: Si se utiliza el kit de desfosforilación rápida (NEB n.° M0508), rSAP (NEB n.° M0371) o fosfatasa antártica (NEB n.° M0289), que se pueden inactivar por calor, no se requiere un paso de limpieza. Si la fosfatasa alcalina utilizada es CIP, que no se puede inactivar por calor, se requiere un paso de limpieza (utilizando el kit de limpieza de PCR y ADN Monarch® NEB n.° T1030). P: ¿Son activas las fosfatasas alcalinas en los tampones NE? R: Quick CIP (NEB n.° M0525). La rSAP (NEB n.° M0371) es activa en todos los NEBuffers de enzimas de restricción r1.1, r2.1, r3.1 y en el tampón rCutSmart™ (NEB n.° B6004) y puede añadirse directamente al ADN digerido. La fosfatasa antártica (NEB n.° M0289) tiene un requerimiento estricto de zinc y su actividad óptima es de pH 6.0. La fosfatasa antártica puede utilizarse en los NEBuffers 1, 2, 3 o 4, así como en los exclusivos NEBuffers para EcoRI y BamHI, solo cuando se complementa con tampón de reacción de fosfatasa antártica 10X hasta una concentración final de 1X. P: Problema de clonación: Demasiado ruido de fondo en el paso de transformación. R: En caso de que haya demasiado ruido de fondo en el paso de transformación, es importante determinar si se debe a una desfosforilación ineficiente o a un plásmido no digerido que se ha transferido de la digestión de restricción. Para establecer... Para la fuente del fondo, se deben añadir dos muestras de control en el paso de transformación: un vector sin ligasa y un vector desfosforilado con ligasa. Si el número de transformantes presentes en la muestra 1 es elevado, esto indica la presencia de plásmido sin cortar en el ADN del vector. Si el número de transformantes en la muestra 1 es muy bajo, pero el de la muestra 2 es elevado, esto indica una desfosforilación ineficiente. Si se determina que el problema es la desfosforilación, asegúrese de añadir la cantidad recomendada de fosfatasa por cada cantidad de sustrato. Además, asegúrese de incubar durante el tiempo y la temperatura recomendados. Recomendamos inactivar térmicamente las enzimas de restricción antes del paso de desfosforilación, si las enzimas de restricción utilizadas pueden inactivarse térmicamente. También recomendamos inactivar térmicamente la fosfatasa antes del paso de ligadura. Si la fosfatasa utilizada no puede inactivarse térmicamente, recomendamos una limpieza de la columna de ADN antes del paso de ligadura. Esto se puede lograr utilizando nuestro kit Monarch PCR & DNA Cleanup (5 ug) (NEB #T1030).