New England Biolabs, M0301S, Topoisomerasa I (E. coli)

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Definición de la unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que cataliza la relajación de > 95% de 0,5 μg de ADN pUC19 RF I (superenrollado negativamente) en 15 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 25 μl. El superenrollamiento del ADN se evalúa mediante electroforesis en gel de agarosa en ausencia de bromuro de etidio. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 35 mM KCl 50 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿La topoisomerasa I relaja todo el ADN superenrollado al mismo grado o los productos son un equilibrio de varias conformaciones? R: La topoisomerasa I relajará plásmidos superenrollados negativamente. Habrá alguna variación en el número de enlace de las moléculas de ADN relajado, que se distribuirá alrededor de la conformación más preferida. La diferencia de energía entre moléculas de ADN con diferentes números de enlace es bastante pequeña y se distribuirán alrededor de una media. Por lo tanto, en un gel de agarosa sin bromuro de etidio, se observará una distribución de bandas incluso para una reacción completa. Estas bandas deberían seguir discurriendo lentamente y se distinguen fácilmente de los plásmidos superenrollados. P: Si el ADN resultante de una reacción de Topoisomerasa I se procesa en un gel de bromuro de etidio y parece no haber evidencia de actividad enzimática, ¿cuál es la explicación más probable? R: El bromuro de etidio se intercala entre las bases del ADN e induce el superenrollamiento. Todos los plásmidos relajados, independientemente del número de enlace, se superenrollarán en presencia de bromuro de etidio y parecerán discurrir en la misma posición equivalente a cualquier ADN superenrollado en la muestra. Por lo tanto, para verificar el resultado de una reacción de Topoisomerasa I, los productos DEBEN correrse en un gel sin bromuro de etidio. Después de correr el gel, puede teñirse con bromuro de etidio para visualizar el ADN. Las formas relajadas del plásmido correrán más lentamente y en la parte superior del gel. Cualquier plásmido superenrollado correrá más rápido y más abajo en el gel. P: ¿Cuál es el peso molecular de la Topoisomerasa I? R: El peso molecular de la Topoisomerasa I es de 97,4 kDa. P: ¿Puede la Topoisomerasa I relajar el ADN superenrollado tanto positiva como negativamente? R: No. La Topoisomerasa I de E. coli solo puede relajar el ADN superenrollado negativamente. P: ¿Tiene la Topoisomerasa I de E. coli las mismas propiedades que la Topoisomerasa I de Vaccinia? R: No. La Topoisomerasa I de E. coli solo puede relajar el ADN superenrollado negativamente. La topoisomerasa I de Vaccinia puede relajar el ADN superenrollado, tanto negativo como positivo. P: ¿La topoisomerasa I producirá roturas monocatenarias en un plásmido? R: Los plásmidos relajados con topoisomerasa I no contendrán roturas monocatenarias. Cualquier plásmido mellado preexistente permanecerá como tal en la muestra. P: ¿Pueden darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NEB? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de migrar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan rAlbúmina. Creemos que alejarnos de los productos que contienen ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.