New England Biolabs, M0305S, Endonucleasa V

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas de estructura específica Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 1 pmol de un dúplex de oligonucleótido de 34 meros que contiene un solo sitio de desoxiinosina* en un volumen de reacción total de 10 μl en 1 hora a 37 °C. * Un sitio de desoxiinosina se prepara sintéticamente con un dl en el medio de una hebra de un dúplex de oligonucleótido de 34 meros. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 4 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 4 50 mM de acetato de potasio 20 mM de Tris-acetato 10 mM de acetato de magnesio 1 mM de DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM de Tris-HCl 250 mM de NaCl 0,1 mM de EDTA 50 % de glicerol 0,15 % de Triton® X-100 1 mM de DTT 200 µg/ml de BSA pH 8 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 1X NEBuffer 4 que contiene 10 pmol de dúplex de oligonucleótidos marcados con fluorescencia en un volumen total de 10 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el peso molecular de la endonucleasa V? A: El peso molecular de la NEB Endonucleasa V es 80 kDa porque se produce como una fusión MBP (MBP MW = 55 kDa) P: ¿Qué sustrato se utiliza para probar la actividad de la Endonucleasa V? R: Los sustratos que utilizamos para probar la actividad enzimática se enumeran bajo la definición de unidad de cada enzima. En el caso de la Endonucleasa V, se utiliza un dúplex de oligonucleótidos de 34 meros que contiene un solo sitio de desoxiinosina. P: ¿Cuál es la actividad de la Endonucleasa V en los diferentes NEBuffers? R: La actividad de la Endonucleasa V en los NEBuffers es la siguiente: NEBuffer 1: 75% de actividad; NEBuffer 2: 50% de actividad; NEBuffer 3: 100% de actividad; NEBuffer 4: 100% de actividad. P: ¿Qué tan bien escinde la Endonucleasa V en los sitios U:A? R: La Endonucleasa V no funciona bien en los sitios U:A. Sin embargo, escindirá el enlace fosfodiéster 3' a un desajuste de desoxiuridina si se trata de un desajuste U:G. Para obtener más información, consulte la página "Glicosilasas de reparación de ADN en diversas bases de daño" en nuestro sitio web. P: ¿Puede la endonucleasa V escindir el bucle en una estructura de ADN de tallo-bucle? R: Sí, se ha descrito que la endonucleasa V puede escindir el bucle en una estructura de ADN de tallo-bucle. P: ¿Puede una muesca generada por la actividad de la endonucleasa V repararse con la ADN ligasa? R: Sí, una muesca generada por la endonucleasa V puede ser ligada por la ADN ligasa. P: ¿Puede la endonucleasa V reconocer y escindir desajustes? R: Sí. La endonucleasa V reconoce desajustes. Sin embargo, la eficiencia del escindimiento en estos sitios es muy baja. P: ¿Cuál es la diferencia entre la endonucleasa V (#M0305) y la endonucleasa termoestable Q (#M0701)? R: Aunque tanto la endonucleasa V como la endonucleasa termoestable Q reconocen la desoxiinosina en sustratos de ADN, lo que resulta en la formación de una muesca con un 3′-OH y un 5′-fosfato, la ubicación de la muesca es diferente. La endonucleasa V escinde el segundo enlace fosfodiéster en el lado 3′ de la desoxiinosina; la endonucleasa termoestable Q escinde el enlace fosfodiéster inmediatamente en el lado 5′ de la desoxiinosina. Además, la actividad de la endonucleasa V es óptima a 37 °C y puede inactivarse por calor; la actividad de la endonucleasa termoestable Q es óptima entre 65 °C y 85 °C y no puede inactivarse por calor.