New England Biolabs, M0309S, Mezcla reparadora PreCR®

Recupere muestras de ADN dañadas, comprometidas o degradadas Categorías relacionadas Manipulación de ADN, Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Aplicaciones PCR, Preguntas frecuentes sobre PCR P: ¿PreCR ligará mis fragmentos de ADN? R: La ligasa presente en la mezcla de reparación PreCR es Taq ADN ligasa (NEB #M0208). Esta ligasa sella eficazmente las mellas en el ADN, pero no es eficaz para ligar fragmentos en un desajuste o para ligar ADN de extremos romos. De hecho, nunca hemos observado que esta enzima ligue ADN de extremos romos. P: ¿Cuánto ADN reparará PreCR? R: Aunque recomendamos hasta 500 ng en la tarjeta de datos, esto es solo una generalización. La cantidad de ADN que se puede reparar depende de muchos factores, como el tipo de daño o daños y la cantidad total de daño. Hemos reparado 1 µg de ADN usando 1 µL del cóctel de enzimas PreCR Repair Mix y no consideramos que este sea el límite superior real. La otra cara de esta pregunta es qué tan poco ADN es seguro usar con la mezcla reparadora PreCR. No hemos encontrado un límite inferior de concentración de ADN para la reparación. Normalmente, la concentración de ADN en la reacción de la mezcla reparadora PreCR no es un factor importante para realizar la reacción. P: ¿Tratar mi ADN con la mezcla reparadora PreCR afectará mi reacción? R: No. No hemos observado que la mezcla reparadora PreCR tenga un efecto negativo en una reacción de PCR. Debido a la complejidad del daño al ADN, puede haber casos en los que el tratamiento con PreCR tenga un efecto negativo. Un posible escenario sería una situación en la que el ADN degradado sea mayoritariamente monocatenario. Algunas enzimas reparadoras pueden actuar sobre el ADN monocatenario, pero este carece de la cadena complementaria necesaria para una reparación completa. P: ¿Cuál es la secuencia de la mezcla de cebadores L1? R: La mezcla contiene un cebador directo e inverso. Las secuencias de los cebadores son: CCTGCTCTGCCGCTTCACGC y GATGACGCATCCTCCACGATAATATCCGG para los cebadores directo e inverso, respectivamente. Estos cebadores se describen en Wang, Y., et al., Nucleic Acids Res. (2004) 32(3):1197. P: ¿Cómo se crea el ADN dañado contra el que se prueba la mezcla de reparación PreCR? ¿Puedo comprar este ADN dañado por separado? R: Hemos probado la mezcla de reparación PreCR en ADN que tiene sitios abásicos, bases oxidadas, daño UV y dU además de ADN dañado por calor. Los sitios abásicos se generan por incubación a pH 5 como se describe en Ide, H., et al (Biochemistry (1993) 32(32):8276-83). La oxidación del ADN se acelera con azul de metileno (Boiteux, S., et al, (1992) 31(1):106-10). Daño UV por exposición a una luz UV. El ADN plasmídico con dU se obtiene de una cepa dut-/ung- de E. coli K12 CJ236 (NEB#E4141). El ADN dañado por UV está disponible en NEB solo como parte del kit PreCR Repair Mix. P: ¿Por qué mi reacción de control no da un amplicón detectable? R: Intente aumentar el número de ciclos de 25 a 30. P: ¿Puedo comprar alguno de los componentes de PreCR Repair Mix por separado? R: Los 2 componentes que no se venden por separado son: la mezcla de cebadores L1 y el ADN lambda dañado por UV. P: ¿PreCR Repair Mix despuntará los extremos del ADN? R: No. La polimerasa presente en PreCR, Bst polI, rellenará los salientes 5', pero no eliminará los salientes 3'. Además, esta polimerasa añadirá un dA al saliente 5' rellenado. Si se desean fragmentos de ADN de extremos romos después del tratamiento con PreCR, utilice el siguiente protocolo. Protocolo de despuntado. Este protocolo utiliza el tampón de reparación óptimo (tampón ThermoPol), pero es mejor limpiar el ADN antes de realizar la reacción de despuntado por dos razones. 1) La polimerasa Bst, si está activa, añadirá un dA al ADN despuntado y, por lo tanto, competirá con la polimerasa elegida para realizar la reacción de despuntado. 2) Si el ADN despuntado necesita ser fosforilado usando T4 PNK, entonces el (NH4)2SO4 presente en el tampón ThermoPol debe eliminarse porque se sabe que inhibe T4 PNK. El protocolo comienza con la realización de la reacción de reparación del ADN como se describe en la tarjeta de datos de la mezcla de reparación PreCR. Después de la reparación, el ADN debe purificarse, es decir, columna de centrifugación, precipitación con etanol. El ADN purificado se somete a despuntado. Para el despuntado del ADN, recomendamos el kit Quick Blunting (NEB#E1201). Para el despuntado y la ligadura, NEB ha incluido convenientemente los kits Quick Blunting y Quick Ligation (NEB#E0542). P: ¿Por qué no veo la banda esperada en mi plantilla reparada? R: Hay varios problemas posibles. En primer lugar, si es posible, conviene asegurarse de que la reacción de PCR esté correctamente optimizada utilizando una plantilla de ADN nueva. Por ejemplo, si se amplifica ADN de muestras de polilla degradadas, se debe comprobar la reacción de PCR utilizando una muestra de ADN nueva de la misma especie. En segundo lugar, es posible que el ADN extraído contenga inhibidores de la PCR. Esto se puede comprobar utilizando una reacción de PCR de eficacia comprobada y añadiendo una alícuota del ADN extraído. Si la reacción de PCR se ve inhibida por la presencia del ADN extraído en cuestión, los inhibidores de la PCR pueden ser un problema. En este caso, es importante utilizar albúmina en las reacciones de reparación y amplificación, ya que se sabe que la albúmina mitiga los efectos de algunos tipos de inhibidores de la PCR. Otro método sencillo, pero eficaz, consiste en realizar una serie de reacciones de PCR en las que la plantilla de ADN extraída esté presente en un rango de diluciones. La idea es encontrar el punto en el que el inhibidor esté lo suficientemente diluido como para permitir la PCR y que aún haya suficiente plantilla de ADN para permitir la amplificación. Otros problemas son que el ADN está simplemente demasiado degradado para ser recuperado o que el daño presente no es reparado por la PreCR Repair Mix, es decir, los enlaces cruzados de ADN-proteína. P: ¿Es mi tampón compatible y qué reacción debo usar? R: Si su tampón es uno de los siguientes: Thermopol, stadard Taq, Phusion HF, Pusion GC o tampón DyNazyme Ext, puede usar el protocolo estándar. Si su tampón es uno de los siguientes: AccuTaqLA, Pfu, iTaq o Accu-prime Pfx, use el protocolo de reacción secuencial. P: ¿La PreCR Repair Mix inserta nucleótidos aleatorios en la secuencia que repara? R: No, la polimerasa en la mezcla agrega las bases complementarias que corresponden a la plantilla. La mezcla de reparación no introducirá cambios en la secuencia. P: ¿La PreCR Repair Mix contiene ADN humano contaminante? ¿Cuáles son los controles de calidad que se utilizan para probar eso? R: La PreCR Repair Mix no está certificada como libre de ADN humano. Los ensayos de control de calidad se realizan en su totalidad en ADN de E. coli, no en sustratos humanos. P: ¿La mezcla reparadora PreCR elimina las modificaciones covalentes de las bases del ADN, como la biotina o la digoxigenina? ¿Repara los desajustes o bases adicionales en el ADN? R: Esta mezcla reparadora no eliminará la modificación covalente en las bases del ADN. Reparará los daños básicos del ADN, como los sitios abásicos, las mellas, los dímeros de timina, la citosina desaminada, la guanina oxidada y la pirimidina. También pule el extremo 3' a hidroxilo si hay un bloqueo en el extremo 3'. Si los desajustes entran en esas categorías, sí, PreCR lo reparará. De lo contrario, no. P: Si quedan huecos y mellas de una reacción de ligadura, ¿la mezcla reparadora PreCR los reparará todos, de modo que el ADN sea adecuado para la microinyección en ratones, por ejemplo? R: La ADN polimerasa Bst de longitud completa es la ADN polimerasa presente en la mezcla reparadora PreCR. Esta polimerasa rellena los huecos y elimina las bases dañadas cuando así lo indican las enzimas reparadoras de la mezcla. La ADN polimerasa Bst puede realizar esto gracias a su actividad exonucleasa 5'-3', además de la actividad ADN polimerasa. Sin embargo, no presenta actividad exonucleasa 3'-5', también conocida como actividad de corrección de errores. P: ¿Se puede utilizar la mezcla reparadora PreCR para ADN embebido en parafina? R: La mezcla reparadora PreCR no funciona con muestras fijadas. Si se puede extraer el ADN de las muestras fijadas, la mezcla reparadora PreCR puede utilizarse para reparar el ADN purificado. P: El ADN reparado se utilizará para una digestión con Nsp1 o Sty1, seguida de una ligadura de adaptadores y PCR. ¿Recomiendan limpiar la reacción de la mezcla reparadora PreCR antes de este proceso? R: Si la polimerasa de la mezcla reparadora PreCR sigue presente y activa cuando se generan los extremos del ADN mediante la digestión con enzimas de restricción, puede modificar dichos extremos (ya sea rellenando el saliente o añadiendo una dA sin plantilla, de forma similar a la Taq ADN polimerasa) e interferir con los pasos posteriores. Por lo tanto, se recomienda un paso de eliminación térmica (80 °C durante 20 minutos) o una limpieza del ADN. El ADN puede precipitarse con etanol o purificarse mediante una columna de centrifugación. P: ¿Puede la mezcla reparadora PreCR reparar daños en ADN monocatenario y bicatenario? ¿O requiere ADN bicatenario como plantilla? R: La mezcla reparadora PreCR se utiliza con ADN bicatenario. Algunas de las enzimas reparadoras del ADN que contiene la mezcla pueden reconocer daños en el ADN monocatenario, pero los pasos de polimerización y ligadura requieren ADN bicatenario. P: ¿Es necesario añadir dNTP para que la mezcla reparadora PreCR funcione correctamente? R: Sí. La reparación se verá afectada si no se añaden dNTP. P: Si tuviera una plantilla de ADN con sitios de mutación (p. ej., 8-oxoguanina o citosinas deaminadas) directamente adyacentes en cadenas opuestas, ¿el tratamiento con PreCR™ Repair Mix causaría una muesca o rotura en la doble cadena? R: No hemos probado la reparación de una rotura en la doble cadena. En este caso, si las dos bases dañadas se eliminan al mismo tiempo, podría producirse una rotura en la doble cadena, lo que resultaría en ADN fragmentado. El ADN muy fragmentado es difícil de reparar. Si, por otro lado, una reacción es más rápida que la otra y no ocurren simultáneamente, lo más probable es que PreCR Repair Mix las repare. P: ¿Qué longitudes de hueco se pueden reparar con PreCR Repair Mix? R: Se desconoce la longitud exacta del hueco. Según nuestra experiencia, está entre 5 y 10 nucleótidos. P: ¿PreCR Repair Mix funciona con cantidades de ADN menos concentradas (p. ej., 500 pg-1 ng) que las recomendadas? R: La mezcla de reparación se ha probado con cantidades de ADN molde tan bajas como 100 pg. En este caso, la reparación basada en PreCR se produce también con las concentraciones de ADN más altas mencionadas en la tarjeta de datos. La concentración inicial de ADN molde recomendada para la reparación, de 50 a 500 ng, es simplemente una condición de reacción sugerida y no representa los límites de concentración de ADN a los que la mezcla de reparación PreCR puede llevar a cabo la reparación. P: Al realizar tratamientos de plantillas con bisulfito, las reacciones de PCR posteriores pueden ser problemáticas, ya que el ADN parece ser muy lábil después del tratamiento. ¿Puede la mezcla de reparación PreCR mejorar estos resultados de PCR? R: Nuestra mezcla actual contiene UDG y no repara plantillas de ADN tratadas con bisulfito. Omitir UDG es una buena idea, pero para la secuenciación con bisulfito, el ADN debe pasar por el paso de ADN monocatenario, y nuestra mezcla de reparación PreCR actual no repara el ssDNA lo suficiente. P: ¿Es necesario limpiar la reacción de PreCR antes de realizar la PCR cuantitativa? R: No. Los dNTP de la mezcla de reparación PreCR no están presentes en una concentración lo suficientemente alta como para interferir con la Q-PCR. P: Al trabajar con fragmentos, ¿la mezcla de reacción PreCR ligará los extremos? R: No, la ADN ligasa Taq de la mezcla solo ligará donde haya una muesca en el dsADN. P: ¿Se puede usar la ADN ligasa T4 para ligar a través de un sitio abásico? R: La ADN ligasa T4 no ligará a través de un sitio AP. La mezcla de reparación PreCR fijará el sitio AP (solo en el dsADN), añadirá la base adecuada y luego ligará la estructura del dsADN. P: ¿Cómo repara los sitios abásicos la mezcla de reacción PreCR? ¿Se introducen y ligan nuevos nucleótidos? ¿Se repara el nucleótido existente? R: Las enzimas reparadoras del ADN reconocen el sitio abásico y cortan la cadena principal del ADN. La polimerasa reemplaza la base faltante con la base correcta y la ligasa liga el ADN.