New England Biolabs, M0315S, Transferasa terminal

La transferasa terminal cataliza la adición de desoxinucleótidos al extremo hidroxilo 3' de las moléculas de ADN. Categorías relacionadas: Marcaje de ADN, Aplicaciones de manipulación de ADN, A-tailing, Especificación de PCR. Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que cataliza la incorporación de 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en un volumen total de reacción de 50 µl en 1 hora a 37 °C utilizando d(A) 18 como cebador. Condiciones de reacción Paquete de tampón de reacción de transferasa terminal 1X Suplemento con 0,25 mM de CoCl2 Incubar a 37 °C Paquete de tampón de reacción de transferasa terminal 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento KPO4 50 mM NaCl 100 mM β-ME 1,43 mM Glicerol al 50 % Triton® X-100 al 0,1 % pH 7,3 a 25 °C Inactivación por calor 75 °C durante 20 minutos Peso molecular Teórico: 58000 daltons Exonucleasa 5' - 3' No Exonucleasa 3' - 5' No Desplazamiento de hebra No Unidad Condiciones del ensayo Tampón de reacción de transferasa terminal 1X, 0,72 μM d(A) 18 , 0,2 mM de dTTP y 1 μCi [3 H]- dTTP en un volumen de reacción total de 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Se puede inactivar la transferasa terminal con calor? R: Sí, calentar a 75 °C durante 20 minutos. Alternativamente, las reacciones se pueden detener añadiendo 10 μl de EDTA 0,2 M. P: ¿Puede la transferasa terminal marcar el extremo 5' del ADN? R: No. Utilice la polinucleótido quinasa T4 (NEB n.º M0201) para marcar el extremo 5'. P: ¿Se suministra la transferasa terminal con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden pedir como un juego de 4 tubos individuales, juego de solución de desoxinucleótidos (NEB n.º N0446) con una concentración de 100 mM de cada nucleótido. P: ¿La transferasa terminal requiere Co2+ como catión divalente? R: El CO₂+ aumenta la incorporación de pirimidinas (Maniatis) y hace que la adición a extremos romos y cóncavos sea más eficiente (Protocolos actuales). P: ¿Se puede añadir un solo dNTP al extremo del ADN con la Transferasa Terminal? R: Sí, se pueden añadir nucleótidos individuales mediante la incorporación de un análogo de terminación de cadena, como un didesoxinucleótido (ddATP). P: ¿Tiene la Transferasa Terminal preferencia por un tipo de extremo 3' del ADN? R: La adición de dNTP a extremos 3' OH protuberantes es más eficiente que con extremos 3' OH cóncavos o romos. P: ¿Cuáles son los valores de kM de la Transferasa Terminal? R: * 100 μM para dATP * 100 μM para dTTP * 500 μM para dCTP * 500 μM para dGTP * 1 μM para oligonucleótidos * 1 mM para extremos de cebadores de homopolímeros P: ¿La transferasa terminal añadirá un dNTP no marcado radiactivamente? R: Sí, la transferasa terminal incorporará nucleótidos biotinilados.