New England Biolabs, M0317L, Ligasa de ADN T3

La ligasa de ADN T3 ligará estos sustratos: Categorías relacionadas Aplicaciones de las ligasas de ADN Clonación Ligadura Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para dar una ligadura del 50% de 100 ng de fragmentos HindIII de ADN λ en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 minuto a 25 °C en tampón de ligasa de ADN StickTogether 1X. Condiciones de reacción Tampón de ligasa de ADN 1X StickTogether™ Incubar a 25 °C Tampón de ligasa de ADN 1X StickTogether™ Tris-HCl 66 mM MgCl2 10 mM ATP 1 mM DTT 7,5 % Polietilenglicol (PEG 6000) (pH 7,6 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM DTT 1 mM Glicerol al 50 % EDTA 0,1 mM pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Qué tipo de extremos de ADN puede ligar la ligasa de ADN T3? R: La ligasa de ADN T3 puede ligar extremos cohesivos y romos. P: ¿Se puede utilizar la ligasa de ADN T3 con un tampón que no contenga PEG? R: Sí. Recomendamos el uso de tampón de ligasa de ADN 1X T4. Tenga en cuenta que la actividad específica de la T3 ADN ligasa en un tampón que no contiene PEG es menor, aproximadamente 10 veces. P: ¿Tiene la T3 ADN ligasa una mayor tolerancia a la sal que la T4 ADN ligasa? R: Sí. La T3 ADN ligasa puede tolerar concentraciones de sal de hasta 250-300 mM en la reacción. Tenga en cuenta que, en presencia de PEG, el ADN en una solución con alto contenido de sal precipitará, inhibiendo la ligación. Si desea ligar ADN en presencia de sal superior a 100 mM, recomendamos el uso del tampón 1X T4 ADN ligasa. P: ¿Se puede inactivar la T3 ADN ligasa por calor? R: Sí, calentar una reacción que contiene T3 ADN ligasa a 65 °C durante 10 minutos inactivará la enzima. Sin embargo, la reacción debe realizarse en un tampón sin PEG. No inactive por calor si hay PEG en el tampón de reacción, ya que se inhibirá la transformación. P: ¿Cuáles son algunos de los posibles problemas con la reacción de ligadura usando la ADN ligasa T3 que pueden provocar un fallo de transformación? R: La ligadura falló porque no había ATP ni Mg2+. Use el tampón suministrado o añada ATP a un tampón compatible. El ATP de los tampones con más de un año de antigüedad puede haberse degradado lo suficiente como para causar problemas. Al suplementar con ATP, asegúrese de usar ribo ATP, ya que el desoxirribo ATP no funcionará. La ligadura falló debido a un alto contenido de sal o EDTA en la reacción. Limpie el ADN. El CIP, el BAP o el SAP no se inactivaron completamente en el paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa. La ligadura produjo solo ADN lineal porque la concentración de ADN era demasiado alta. Mantenga la concentración total de ADN entre 1 y 10 μg/ml. El inserto y el plásmido no contienen fosfatos. Nota: los cebadores pueden no contener fosfatos, lo que puede provocar problemas en la ligadura de extremos romos en vectores tratados con CIP. Solicite cebadores con fosfatos o quinase los cebadores. Se añadió demasiada mezcla de ligadura a las células. Añada entre 1-5 μl y 50 μl de células competentes. La ligasa estaba inactiva. Pruebe en lambda HindIII u otro sustrato adecuado. La mezcla de ligadura contenía PEG y se incubó durante la noche. La ligadura prolongada con PEG provoca una disminución de la eficiencia de la transformación. Esto podría deberse a la producción gradual de grandes fragmentos lineales de ADN que pueden inhibir la transformación. La mezcla de ligadura no se purificó antes de la electroporación. Debe eliminarse el tampón o la sal generará una chispa. Dialice la muestra o utilice una columna de centrifugación para purificarla. El PEG del tampón del kit de ligadura rápida (NEB n.° M2200) previene la chispa, pero también la electroporación. El PEG debe eliminarse mediante una columna de centrifugación. P: ¿Qué otros problemas deben tenerse en cuenta al resolver un problema de transformación? R: Las células no son viables. Analice los controles que se indican a continuación y obtenga nuevas células si es necesario. Las células no son competentes. Analice los controles que se indican a continuación y obtenga nuevas células si es necesario. La proteína recombinante no es bien tolerada por E. coli. Intente hacer una fusión con proteína de unión a maltosa usando el sistema pMAL (NEB# E8000S). Intente otro sistema de expresión que no involucre a E. coli. El ADN ligado incluía repeticiones invertidas y en tándem seleccionadas contra E. coli. Elimine la secuencia repetida si es posible. Intente otro sistema de expresión que no involucre a E. coli. El ADN insertado se tomó de mamífero o planta y contiene citosina metilada que es degradada por muchas cepas de E. coli. Use una cepa deficiente en mcrA, mcrBC y mrr. El constructo es demasiado grande (>10,000 pb) para la transformación en células químicamente competentes. Use electroporación. P: ¿Qué problemas se pueden encontrar en la digestión de restricción que pueden causar que la ligadura usando T3 ADN Ligasa o la transformación posterior falle? R: La enzima de restricción no escindió eficientemente. Si se escinde cerca del final de un fragmento de PCR * deje al menos 6 bases más allá del sitio de restricción. Pruebe la enzima de restricción en un sustrato de control. La enzima de restricción no se inactivó por completo. El fenol/ETOH purifica el ADN si la enzima no se puede inactivar por calor. La actividad estrella de la digestión de restricción escindió el vector o el inserto. Verifique el ADN en un gel. Si hay una banda adicional, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo para la digestión de restricción. El ADN o la enzima de restricción contenían exonucleasa o fosfatasa que dañaron los extremos. El fenol/ETOH purifica el ADN. Verifique los datos y notas de control de calidad de la enzima. Si el control de calidad de la ligadura es deficiente o el nivel de exonucleasa es alto, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo de incubación. *El proceso de PCR está cubierto por patentes propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. P: ¿Qué controles se deben ejecutar para probar las células y el ADN cuando se usa la ADN ligasa T3? R: Nota: Use la misma concentración de ADN para cada control, típicamente 0,1-1,0 ng por transformación. La transformación del vector sin cortar en las células competentes verifica la viabilidad celular y prueba la resistencia a los antibióticos del plásmido. Sembrar en medio y medio más antibiótico. El vector linealizado prueba el fondo debido a un plásmido no escindido. Debe ser <1% del valor obtenido en 1. El plásmido cortado y religado prueba la actividad de la ligasa y la integridad del extremo del ADN. Debe ser cercano al valor obtenido en 1. El plásmido cortado, fosfatado y religado prueba el fondo debido a un tratamiento incompleto con fosfatasa. Debe ser <1% del valor obtenido en 1. P: ¿Cuánto ADN se debe usar en una ligadura con ADN ligasa T3? R: Para promover la formación de círculos, útil en la transformación, la concentración total de vector + inserto debe estar entre 1-10 μg/ml para una ligadura eficiente. Las proporciones molares inserto:vector entre 2 y 6 son óptimas para inserciones individuales. Las proporciones inferiores a 2:1 resultan en una menor eficiencia de ligadura. Las proporciones superiores a 6:1 promueven múltiples inserciones. Si no está seguro de sus concentraciones de ADN, realice múltiples ligaduras con proporciones variables. P: ¿Funcionará la ADN ligasa T3 en el tampón rCutSmart? R: La ADN ligasa T3 funciona en el tampón rCutSmart, con la adición de ATP + PEG. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el proceso de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®.