New England Biolabs, M0318S, Ligasa de ADN T7

La ligasa de ADN T7 ligará estos sustratos: Categorías relacionadas Aplicaciones de las ligasas de ADN Clonación Ligadura Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para dar una ligadura del 50% de 100 ng de fragmentos HindIII de ADN λ en un volumen de reacción total de 20 μl en 30 minutos a 25 °C en tampón de ligasa de ADN StickTogether 1X. Condiciones de reacción 1X StickTogether™ DNA Ligase Buffer Incubar a 25 °C 1X StickTogether™ DNA Ligase Buffer 66 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM ATP 1 mM DTT 7,5 % Polietilenglicol (PEG 6000) (pH 7,6 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: La ADN ligasa T7 se describe como una enzima que solo liga fragmentos de ADN con extremos cohesivos. ¿Qué longitud de extremo cohesivo puede ligar la ADN ligasa T7? R: La ADN ligasa T7 puede ligar fragmentos de ADN con extremos cohesivos de 2 pb o más. La ADN ligasa T7 liga los salientes de 1 pb de forma ineficiente. La ADN ligasa T7 no liga eficazmente los fragmentos de ADN con extremos romos, excepto en condiciones de reacción con concentraciones muy altas de PEG (20-30 % p/v). P: ¿Se puede utilizar la ADN ligasa T7 con un tampón que no contenga PEG? R: Sí. Recomendamos el uso del tampón 1X ADN ligasa T4. Tenga en cuenta que la actividad específica de la ADN ligasa T7 en un tampón que no contenga PEG es aproximadamente 10 veces menor. P: ¿Se puede inactivar la ADN ligasa T7 por calor? R: Sí, calentar una reacción que contiene ADN ligasa T7 a 65 °C durante 10 minutos inactivará la enzima. Sin embargo, la reacción debe realizarse en un tampón sin PEG. No inactive por calor si hay PEG en el tampón de reacción, ya que se inhibirá la transformación. P: ¿Cuáles son algunos de los posibles problemas con la reacción de ligación utilizando la ADN ligasa T7 que pueden provocar un fallo de transformación? A: La ligadura falló porque no había ATP ni Mg2+. Use el tampón suministrado o añada ATP a un tampón compatible. El ATP de los tampones de más de un año puede haberse degradado lo suficiente como para causar problemas. Al complementar con ATP, asegúrese de usar ribo ATP, ya que el desoxirribo ATP no funcionará. La ligadura falló debido a un alto contenido de sal o EDTA en la reacción. Limpie el ADN. El CIP, el BAP o el SAP no se inactivaron completamente en el paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa. La ligadura produjo solo ADN lineal porque la concentración de ADN era demasiado alta. Mantenga la concentración total de ADN entre 1 y 10 μg/ml. El inserto y el plásmido no tienen fosfatos. Nota: los cebadores pueden no tener fosfatos, lo que provoca problemas en la ligadura de extremos romos en vectores CIPeados. Solicite cebadores con fosfatos o quinase los cebadores. Se añadió demasiada mezcla de ligadura a las células. Añadir entre 1-5 μl y 50 μl de células competentes. La ligasa estaba inactiva. Realizar la prueba en lambda HindIII u otro sustrato adecuado. La mezcla de ligación contenía PEG y se incubó durante la noche. La ligación prolongada con PEG disminuye la eficiencia de la transformación. Esto podría deberse a la producción gradual de grandes fragmentos lineales de ADN que pueden inhibir la transformación. La mezcla de ligación no se purificó antes de la electroporación. Debe eliminarse el tampón o la sal generará una chispa. Dializar la muestra o utilizar una columna de centrifugación para purificarla. El PEG del tampón del kit de ligación rápida (NEB n.° M2200) previene la chispa, pero también la electroporación. El PEG debe eliminarse mediante una columna de centrifugación. P: ¿Qué otros problemas deben tenerse en cuenta al resolver un problema de transformación? R: Las células no son viables. Analice los controles que se indican a continuación y obtenga nuevas células si es necesario. Las células no son competentes. Analice los controles que se indican a continuación y obtenga nuevas células si es necesario. E. coli no tolera bien la proteína recombinante. Intenta hacer una fusión con proteína de unión a maltosa usando el sistema pMAL (NEB# E8000S). Prueba otro sistema de expresión que no involucre E. coli. El ADN ligado incluía repeticiones invertidas y en tándem seleccionadas contra E. coli. Elimina la secuencia repetida si es posible. Prueba otro sistema de expresión que no involucre E. coli. El ADN insertado se tomó de mamífero o planta y contiene citosina metilada que es degradada por muchas cepas de E. coli. Usa una cepa deficiente en mcrA, mcrBC y mrr. El constructo es demasiado grande (>10,000 pb) para la transformación en células químicamente competentes. Usa electroporación. P: ¿Qué problemas se pueden encontrar en la digestión de restricción que pueden causar que la ligadura usando T7 ADN Ligasa o la transformación posterior falle? R: La enzima de restricción no escindió eficientemente. Si escinde cerca del final de un fragmento de PCR * deja al menos 6 bases más allá del sitio de restricción. Prueba la enzima de restricción en un sustrato de control. La enzima de restricción no se inactivó por completo. El fenol/ETOH purifica el ADN si la enzima no puede inactivarse por calor. La actividad estrella de la digestión de restricción escindió el vector o inserto. Verifique el ADN en un gel. Si hay una banda adicional, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo para la digestión de restricción. El ADN o la enzima de restricción contenían exonucleasa o fosfatasa que dañaron los extremos. El fenol/ETOH purifica el ADN. Verifique los datos y notas de control de calidad de la enzima. Si el control de calidad de la ligadura es deficiente o el nivel de exonucleasa es alto, reduzca la cantidad de enzima o el tiempo de incubación. *El proceso de PCR está cubierto por patentes propiedad de Roche Molecular Systems, Inc. P: ¿Cuánto ADN se debe usar en una ligadura con ADN ligasa T7? R: Para promover la formación de círculos, útil en la transformación, la concentración total de vector + inserto debe estar entre 1-10 μg/ml para una ligadura eficiente. Las relaciones molares inserto:vector entre 2 y 6 son óptimas para inserciones simples. Las relaciones inferiores a 2:1 resultan en una menor eficiencia de ligadura. Las proporciones superiores a 6:1 promueven múltiples inserciones. Si no está seguro de las concentraciones de ADN, realice múltiples ligaduras con proporciones variables. P: ¿Funcionará la ADN ligasa T7 en el tampón rCutSmart? R: La ADN ligasa T7 funcionará en el tampón rCutSmart, con la adición de ATP y PEG. Para ver su porcentaje de actividad funcional en rCutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el flujo de trabajo de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®.