New England Biolabs, M0319S, ligasa de ADN/ARN termoestable de 5' App

La ligasa termoestable 5' App ADN/ARN ligasa liga un enlazador de ADN 5' preadenilado 3'-bloqueado al 3'-OH del ARN y el ssADN. Categorías relacionadas Ligación de ARN, ADN ligasas Aplicaciones Ligación sin clonación Especificación Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 1 Incubar a 65 °C 1X NEBuffer™ 1 10 mM Bis-Tris-Propano-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM KCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % Glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Cómo se puede sintetizar un enlazador de ADN adenilado? R: Un método eficiente es usar el kit de adenilación de ADN 5' (NEB# E2610) para convertir pDNA en AppDNA. P: ¿Puedo usar la ARN ligasa Mth de tipo silvestre incluida en el kit de adenilación de ADN 5' en lugar de la AppDNA/ARN ligasa termoestable 5' para la construcción de la biblioteca? R: No. La Mth de tipo silvestre es muy eficiente en la adenilación, pero no en la ligación. P: ¿Cuánta AppDNA/ARN ligasa termoestable 5' debo agregar a una reacción? R: La ligasa es un dímero y tiene una rotación muy baja, por lo que se debe agregar al menos un exceso de dos molares de la enzima al sustrato. P: ¿Por qué recomienda agregar MnCl₂ a la ligación de ADN pero no a la reacción de ARN? R: El MnCl₂ no se incluye en la ligación de ARN para reducir la degradación del ARN mediada por metales. P: ¿La AppDNA/ARN ligasa termoestable 5' liga ARN bicatenario o ADN bicatenario? R: No, la enzima solo utiliza sustratos monocatenarios. P: ¿El PEG o un mayor tiempo de incubación aumentarán la cantidad de producto ligado? R: El PEG no mejora la ligación. Puede haber un aumento en el producto ligado al aumentar el tiempo de incubación. P: ¿Por qué el ARN se desplaza como una mancha o se atasca en el pocillo? R: La enzima se une fuertemente al ARN, lo que puede provocar que se desplace como una mancha o se atasque en el pocillo. El calentamiento a 90 °C durante 3 minutos o el tratamiento con proteinasa K liberan el ARN; algunas muestras requieren tratamiento con proteinasa K. P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? A: NEB # Tolerancia a la sal de la ligasa de ARN M0204 T4 ARN ligasa 1 (ligasa de ARNmc) ≤ 50 mM M0239 T4 ARN ligasa 2 (ligasa de ARNdc) ≤ 50 mM M0242 T4 ARN ligasa 2, truncada ≤ 100 mM M0351 T4 ARN ligasa 2, truncada K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 ARN ligasa 2, truncada KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligasa ≤ 50 mM E2610 Kit de adenilación 5' (ligasa Mth) ≤ 300 mM M0319 Ligasa de ADN/ARN termoestable 5' App ≤ 50 mM