New England Biolabs, M0332L, Hemo KlenTaq®

Elimina la extracción y purificación de ADN Categorías relacionadas Otras polimerasas de PCR Aplicaciones PCR sin extracción,, PCR especial,, Especificación de PCR Condiciones de reacción Paquete de tampón de reacción Hemo KlenTaq® 1X Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM KCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Tween® 20 al 0,5% IGEPAL® CA-630 al 50% Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Exonucleasa 5' - 3' No Exonucleasa 3' - 5' No Condiciones de ensayo unitario Tampón de reacción ThermoPol® 1X, 200 µM dNTP que incluyen [3H]-dTTP y ADN M13 cebado 15 nM. Preguntas frecuentes P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad polimerasa intrínseca de Taq añade un extremo 3'A sin plantilla, mientras que la actividad exonucleasa 3'-5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también reduce el brillo de los productos de PCR. Por ello, estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de annealing adecuada para mi reacción? R: La temperatura de annealing óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB tiene en cuenta los componentes del tampón que afectan a las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la temperatura óptima de annealing de la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una temperatura de annealing única (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico entre sustancias químicas y reactantes que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: Esta sección trata específicamente el annealing de un cebador oligonucleotídico a un molde de ADN. Durante la etapa de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten el annealing (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleotídico monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de annealing (TA) es la temperatura utilizada durante el annealing del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la cual el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. Por qué es importante usar la temperatura de annealing correcta para una PCR exitosa La temperatura de annealing de una reacción es usualmente menor que la temperatura de fusión para asegurar la hibridación del cebador con la plantilla. Si la temperatura de annealing es demasiado alta, el cebador no se annealizará con la plantilla y la amplificación no procederá. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión inespecífica del cebador(es) con la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto inespecífico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de hibridación de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con la adenina y la timina (% de contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuantos más enlaces de hidrógeno (mayor Tm) haya de un cebador con su molde, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTP La concentración libre de iones de magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactivos y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTP, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssDNA) aumenta la concentración del cebador de cationes monovalentes (Na+, K+). Los cationes monovalentes respaldan la estabilidad del dúplex de ADN, de manera similar a los iones de magnesio. Los cationes monovalentes y los iones de magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación no específica, sin amplificación, tamaño de producto incorrecto ¿Resultado curioso? Consulte nuestra Guía de resolución de problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Pautas para la optimización de PCR con ADN polimerasas termófilas y en esta publicación del blog. El soporte técnico siempre está dispuesto a trabajar con usted para solucionar problemas de su PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, En condiciones óptimas, suele observarse una mancha o un fondo alto. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima. Reduzca la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la recomendada por el protocolo específico del producto. Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; pruebe con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación. Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos. Si, además de la mancha, se observa un halo iluminado alrededor del pocillo, use menos plantilla.