New England Biolabs, M0337S, Poli(U) polimerasa

La poli(U) polimerasa cataliza la adición, independiente de la plantilla, de UMP a partir de UTP o de AMP a partir de ATP al extremo 3' del ARN. Categorías relacionadas: Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, Síntesis de ARN, Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN. Especificación de PCR. Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorpora 1 nmol de UMP al ARN en un volumen de 50 μl en 10 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 2 Suplemento con 0,5 mM UTP Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 2 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 1X NEBuffer 2, 0,5 mM 3 H UTP y 5 µg de ARN de levadura se combinan en una reacción de 50 μl incubada a 37 °C durante 10 minutos. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el peso molecular de la poli(U) polimerasa? R: El peso molecular de la polimerasa Poly(U) es de 46 kDa. P: ¿Qué tipo de UTP marcados incorporará la polimerasa Poly(U)? R: La polimerasa Poly(U) incorporará nucleótidos radiactivos. No se han probado nucleótidos marcados con biotina ni fluoróforos. Sin embargo, predecimos que incorporará otras marcas, aunque a una tasa reducida. P: ¿La polimerasa Poly(U) incorporará GTP en el extremo 3' de un ARN? R: La polimerasa Poly(U) puede añadir un número limitado (de 5 a 20) de nucleótidos G al extremo 3' del ARN. La longitud de la adición de poli G varía con los diferentes sustratos de ARN. Por el contrario, la polimerasa Poly(A) es mucho más selectiva y muestra una fuerte preferencia por el ATP en comparación con el rGTP, el rCTP o el UTP. Con la polimerasa Poly(A) se añadirían pocas G, si es que se añadiría alguna. P: ¿Qué longitud de poli(U) se puede esperar que incorpore la poli(U) polimerasa? R: En la reacción estándar recomendada, la longitud de la cola de la poli(U) polimerasa depende tanto del cebador accesible como de la concentración de UTP. Utilizando un cebador con el 100 % de la población extendida, una incubación típica de 30 minutos con 0,5 mM de UTP extenderá todas las moléculas de ARN aproximadamente 1000 bases. P: ¿Puede la poli(U) polimerasa incorporar GTP a un ARN que contenga grupos 2-O-metilo o modificados químicamente en su extremo 3'? R: Sí. Sin embargo, la poli(U) polimerasa tiene un fuerte sesgo del cebador basado en los últimos nucleótidos del extremo 3', por lo que en una población de ARN mixta donde algunos ARN pueden presentar modificaciones, como ser bicatenarios o modificados químicamente con grupos 2-O-metilo, puede requerirse una incubación más prolongada de la reacción. P: ¿Cómo se puede inactivar la poli(U) polimerasa sin calentar la reacción? R: La poli(U) polimerasa se puede inactivar añadiendo EDTA a una concentración final de 20 mM o superior. El ARN con cola se puede purificar mediante extracción con fenol-cloroformo o mediante procedimientos en columna. P: ¿Funciona la poli(U) polimerasa de E. coli en el tampón de transcriptasa inversa M-MuLV? R: Sí. El tampón RT es compatible con la poli(U) polimerasa. P: ¿Se puede utilizar la poli(U) polimerasa para añadir una cola de poli(U) al ADNmc? R: No. La poli(U) polimerasa requiere un cebador de ARN.