Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0338L, XRN-1

La XRN-1 es una exorribonucleasa 5'→3' altamente procesiva que requiere 5' monofosfato. También actúa sobre el ssADN 5' monofosfato con una eficiencia muy reducida. Categorías relacionadas : ARNasas, análisis del epitranscriptoma, especificación de modificación del ARN. Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que digiere 1 µg de ARN de levadura fosforilado en 60 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 3 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 3 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 500 mM NaCl 2 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 Preguntas frecuentes P: ¿Puede XRN-1 digerir ssDNA que contenga 5' monofosfatos? R: Sí. Sin embargo, escindirá ssDNA con menor eficiencia que ARN que contenga 5' monofosfato. P: ¿Es XRN-1 una proteína marcada? R: No, XRN-1 no es una proteína marcada. P: ¿Se identifica XRN-1 con otros nombres en la bibliografía? R: Sí. XRN1 se ha denominado KEM1, SEP1, DST2, RAR5 SKI1 y DST2 en la bibliografía. P: ¿Es XRN-1 tolerante a la sal? R: No se observa una pérdida significativa de actividad a 400 mM de sal. P: ¿Cuál es el peso molecular de XRN-1? R: XRN-1 tiene un peso molecular de 175 kDa. P: ¿Es posible digerir ARN lineales resistentes a la ARNasa R (NEB #M0100)? R: Sí, hemos probado dos métodos para digerir ARN lineales resistentes a la ARNasa R: Recomendamos añadir 1 unidad de ARNasa R, 1 unidad de XRN-1 (NEB #M0338) y 5 unidades de RppH (NEB #M0356) a 1 µg de muestra de ARN en tampón de reacción de ARNasa R 1X. La reacción debe incubarse durante 15 o 30 minutos a 37 °C para una eliminación eficiente del ARN lineal. Pretrate las muestras de ARN con polimerasa de E. coli (NEB #M0276) para alargar los extremos 3' de los ARN, lo que puede mejorar la unión y la actividad de la ARNasa R. Es necesario purificar el ARN antes de proceder con la reacción de la ARNasa R.