New England Biolabs, M0345S, Exonucleasa V (RecBCD)

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 nmol de desoxirribonucleótido soluble en ácido a partir de ADN bicatenario en 30 minutos a 37 °C en un volumen de reacción total de 50 μl. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 4 Suplemento con 1 mM de ATP Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 4 50 mM de acetato de potasio 20 mM de Tris-acetato 10 mM de acetato de magnesio 1 mM de DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM de Tris-HCl 100 mM de NaCl 1 mM de DTT 0,1 mM de EDTA 50 % de glicerol 0,1 % de Triton® X-100 pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 70 °C durante 30 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 1X NEBuffer 4, 1 mM de ATP con 0,15 mM de dúplex sonicado [3H]-ADN. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es el mejor volumen de reacción para la eliminación de dsADN lineal? R: Recomendamos incubar una reacción de 30 µl con 10 unidades de exonucleasa V durante 30 minutos a 37 °C para eliminar 1 µg de ADN bicatenario lineal de entre 100 y 1500 pb. La cantidad de ADN lineal presente se puede estimar mediante electroforesis en gel de agarosa o medición con nanogotas. El ADN tratado se puede purificar aún más mediante precipitación con etanol o columnas de centrifugación (p. ej., Monarch PCR & DNA Cleanup Kit (NEB T1030). Configuración de reacción recomendada (para la eliminación de menos de 1 µg/ul de ADN): dsDNA x μl 10 x NEBuffer 4 3 µl 10 mM ATP 3 µl H2O 23-x µl Exonucleasa V 1 µl Total 30 µl P: ¿El ADN genómico aislado purificado por diferentes métodos cambia la tasa de escisión de la exonucleasa V? R: Sí. La exonucleasa V requiere extremos libres de ADN ss/ds para actuar. El ADN genómico aislado de una columna de centrifugación se digiere más fácilmente, en comparación con el ADN enrollado en varilla de vidrio. En general, 5 unidades de exonucleasa V son suficientes para digerir 1 μg de gDNA (célula HeLa) que se ha purificado mediante una columna de centrifugación, y Se pueden usar 20 unidades de exonucleasa V para digerir 1 μg de ADNg de E. coli en rollo de varilla de vidrio. P: ¿Debo añadir ATP adicional con exonucleasa V si estoy ampliando mi reacción? R: Sí. La exonucleasa V requiere ATP para escindir ADN monocatenario/bicatenario. Sin embargo, una cantidad superior a 1 mM de ATP puede causar inhibición. Si es necesario eliminar más de 1 μg de ADN, se deben aumentar todos los componentes proporcionalmente e incubar la reacción a 37 °C durante 30 min. P: ¿Funciona la exonucleasa V (RecBCD) en otros tampones NE? R: Sí. La exonucleasa V tiene una actividad similar en los tampones NE 2, 3 y 4 (siempre que se añada 1 mM de ATP). Tiene una actividad del 50 % en el tampón NE 1. También tiene una actividad de aproximadamente el 75 % en el tampón de reacción de ADN ligasa T4 sin suplemento de ATP. Recomendamos añadir 1 mM de ATP a la reacción si se usa la exonucleasa V directamente en una reacción de ligación. P: ¿Cuál es la mejor exonucleasa para eliminar el ADN cromosómico durante la preparación de un plásmido? R: La exonucleasa V (RecBCD) elimina el ADN cromosómico residual tras la purificación de un plásmido. P: ¿Qué enzima puede distinguir entre ADN mitocondrial y genómico y solo eliminar el ADN genómico? R: La exonucleasa V (RecBCD) degrada el ADN monocatenario y el ADN bicatenario lineal, preservando el ADN plasmídico mellado y superenrollado. P: ¿Se puede usar la exonucleasa I con una exonucleasa bicatenaria para limpiar preparaciones de plásmidos? R: La exonucleasa I se puede usar con la exonucleasa Lambda (NEB# M0262) para limpiar preparaciones de plásmidos. La exonucleasa III (NEB# M0206) y la exonucleasa T7 (NEB# M0263) también funcionan, pero dañarán Plásmidos mellados. Aunque se puede usar la exonucleasa I, recomendamos usar la exonucleasa V (RecBCD) (NEB n.° M0345) para eliminar el ADN cromosómico después de la preparación del plásmido (consulte nuestra Nota de aplicación: Uso de la exonucleasa V (RecBCD) para eliminar el ADN genómico residual al purificar plásmidos de bajo número de copias con el kit Monarch® Plasmid Miniprep). P: ¿Tiene NEB un equivalente a Plasmid-Safe de Lucigen? R: La exonucleasa V es funcionalmente equivalente a Plasmid-Safe y se puede usar para eliminar el ADN cromosómico contaminante de las preparaciones de plásmidos y mantener el ADN circular bicatenario.