New England Biolabs, M0351L, ARN ligasa T4 2, K227Q truncado

La ARN ligasa T4 2, K227Q truncada, liga el extremo 5' preadenilado del ADN o ARN al extremo 3' del ARN. Categorías relacionadas: Aplicaciones de ligadura de ARN, Clonación de ARN, Unidad de especificación, Definición: 200 unidades se definen como la cantidad de enzima necesaria para lograr una ligadura del 80 % de un ARN de 31 meros al extremo preadenilado de un ADN de 17 meros. Enlace universal de clonación de miRNA (NEB n.° S1315) en un volumen total de reacción de 20 μl en 1 hora a 25 °C. 5´-FAM- rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUrCrArGrCrArArUrA-3´ 5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH 2 -3´ Molaridad: 14 µM Concentración: 200.000 unidades/ml Condiciones de reacción Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X Incubar a 25 °C Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol pH 7,5 a Inactivación por calor a 25 °C 65 °C durante 20 minutos Peso molecular teórico: 71406,97 daltons Actividad específica 200 000 unidades/mg Condiciones del ensayo por unidad Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X suplementado con 10 % (p/v) de PEG PM 8000, 20 pmol de ARN marcado con 5'-FAM y 40 pmol de enlazador de ADN preadenilado. Tras la incubación a 25 °C durante 1 hora, el producto ligado se detecta en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15 %. Preguntas frecuentes P: El peso molecular de T4 Rnl2tr K227Q es de 71,6 kDa. ¿Es una fusión? R: Sí. En nuestras pruebas, la fusión con MBP y las enzimas sin etiquetar funcionan de forma idéntica. P: ¿Se puede utilizar T4 Rnl2tr K227Q en otros tampones NEBuffers? R: Se observa una actividad óptima en su tampón único; sin embargo, la enzima es activa en los tampones NE 1 y 2. P: ¿Existen diferencias en la eficiencia de ligación para T4 Rnl2tr y T4 Rnl2tr K227Q? R: En las pruebas NEB, las ligaciones con T4 Rnl2tr y T4 Rnl2tr K227Q en sustratos idénticos muestran que la eficiencia de ligación alcanza los mismos puntos finales. Sin embargo, T4 Rnl2tr K227 puede requerir tiempos de incubación más largos para alcanzar el punto final de la reacción. Recomendamos incubar las ligaduras de enlaces de ADN preadenilados durante la noche a 16 °C. P: ¿Qué puede ligar T4 Rnl2tr K227Q? R: T4 Rnl2tr K227Q puede realizar las mismas ligaduras que T4 Rnl2tr (NEB n.° M0242). Consulte ARN ligasas para obtener más información. P: ¿El PEG estimula la eficiencia de ligación? R: El PEG 8000 estimula considerablemente la actividad de ligadura de T4 Rnl2tr K227Q. La estimulación máxima se observó con una concentración de PEG 8000 del 15 % (p/v). El PEG 4000 también es estimulante, con un efecto de concentración similar al del PEG 8000. P: ¿Cómo puedo aumentar la eficiencia de la ligadura? R: En general, un mayor tiempo de reacción, una temperatura de reacción más baja y la concentración molecular producen reacciones de ligadura más completas. Los tiempos de reacción pueden aumentarse hasta 24 horas o más. Para ligaduras de más de 2 horas, incubamos habitualmente a menos de 16 °C. Algunos científicos informan que la ligadura se realiza en hielo (0 °C) durante 24 horas. Recomendamos el uso de PEG 4000 u 8000 hasta un 15 % (p/v). Aumentar aún más la concentración de PEG no aumentó la eficiencia de la ligadura. P: ¿Se puede comprar PEG 8000? R: PEG 8000 se incluye como componente del tampón de reacción de la ARN ligasa T4 (NEB n.° B0216). P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? R: N.° de NEB ARN ligasa Tolerancia a la sal M0204 ARN ligasa 1 T4 (ligasa de ARN monocatenario) ≤ 50 mM M0239 ARN ligasa 2 T4 (ligasa de ARN bicatenario) ≤ 50 mM M0242 ARN ligasa 2 T4, truncada ≤ 100 mM M0351 ARN ligasa 2 T4, truncada K277Q ≤ 100 mM M0373 ARN ligasa 2 T4, truncada KQ ≤ 100 mM M0375 Ligasa SplintR ≤ 50 mM E2610 Kit de adenilación 5' (ligasa Mth) ≤ 300 mM M0319 Ligasa de ADN/ARN termoestable 5' App ≤ 50 mM