New England Biolabs, M0356S, ARN 5' pirofosfohidrolasa (RppH)

La ARN 5' pirofosfohidrolasa (RppH) elimina el pirofosfato del extremo 5' del ARN trifosforilado para dejar un ARN 5' monofosfato. Categorías relacionadas: Aplicaciones de modificación de ARN, Clonación de ARN, Unidad de especificación, Definición: Una unidad es la cantidad de enzima que convierte 1 µg de transcrito de ARN de 300 meros en un ARN digerible por XRN-1 en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ 2 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ 2 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 200 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,01 % Triton® X-100 pH 7,5 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Puede la RppH sustituir a la pirofosfatasa ácida del tabaco (TAP) como enzima decapante? R: La actividad principal de la RppH es eliminar los pirofosfatos del extremo 5' del ARN trifosfato. Sin embargo, la RppH también tiene actividad decapante y dejará un monofosfato 5' cuando se incuba con ARN caperuzado. Aquí hay un enlace al protocolo para esta aplicación: https://www.neb.com/protocols/2015/01/14/decapping-eukaryotic-mrna-with-rpph-neb-m0356. Hay una referencia al final del protocolo que destaca la actividad de decapping de RppH. Aunque no hemos realizado una comparación directa entre RppH y TAP internamente, hemos recibido comentarios positivos significativos de clientes que usan la enzima en lugar de TAP. Tenga en cuenta que los clientes que usan el protocolo de decapping deberán comprar el tampón Thermopol 10X (NEB#B9004) por separado. La enzima se vende con NEBuffer 2, que es ideal para su actividad de eliminación de pirofosfato. Referencia: Hetzel J, Duttke SH, Benner C, Chory J. La secuenciación de ARN naciente revela características distintivas en la transcripción de plantas. Actas de la Academia Nacional de Ciencias. 2016;113:12316–21. Neri F, Rapelli S, Krepelova A, Incarnato D, Parlato C, Basile G, et al. La metilación intragénica del ADN previene la iniciación de la transcripción espuria. Nature. 2017;543:72–7. P: ¿Se puede inactivar la RppH por calor? R: Sí, la RppH se puede inactivar por calor incubándola a 65 °C durante 20 minutos. Sin embargo, no se recomienda el tratamiento térmico debido al riesgo de degradación del ARN. Se prefieren métodos alternativos, como la limpieza del ARN o la extinción con EDTA, para preservar la integridad del ARN. P: ¿Es la ARN 5' pirofosfohidrolasa (RppH) tolerante a la sal? R: Recomendamos mantener las condiciones de reacción por debajo de 200 mM de sal. P: ¿Es posible digerir ARN lineales resistentes a la ARNasa R (NEB n.° M0100)? R: Sí, hemos probado dos métodos para digerir ARN lineales resistentes a la ARNasa R: Recomendamos añadir 1 unidad de ARNasa R, 1 unidad de XRN-1 (NEB #M0338) y 5 unidades de RppH (NEB #M0356) a 1 µg de muestra de ARN en tampón de reacción de ARNasa R 1X. La reacción debe incubarse durante 15 o 30 minutos a 37 °C para una eliminación eficiente del ARN lineal. Pretrate las muestras de ARN con polimerasa de E. coli (NEB #M0276) para alargar los extremos 3' de los ARN, lo que puede mejorar la unión y la actividad de la ARNasa R. El ARN debe purificarse antes de proceder con la reacción de la ARNasa R.