New England Biolabs, M0366S, ARNm Cap 2'-O-Metiltransferasa

La caperuza 2'-O-metiltransferasa del ARNm añade un grupo metilo en la posición 2'-O del primer nucleótido adyacente a la estructura de caperuza en el extremo 5' del ARN. Categorías relacionadas: Definición de la unidad de especificación de caperuza del ARN. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para metilar 10 pmoles de un transcrito de ARN con caperuza de 80 nt de longitud en una hora a 37 °C. Condiciones de reacción 1X tampón de taponamiento Suplemento con 0,2 mM de S-adenosilmetionina (SAM) Incubar a 37 °C 1X tampón de taponamiento 50 mM Tris-HCl 5 mM KCl 1 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 20 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 8 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Qué tipo de ARN se puede metilar utilizando la ARNm Cap 2'-O-metiltransferasa? R: La ARNm Cap 2'-O-metiltransferasa requiere ARN con capuchón como sustrato. El ARN con capuchón se puede preparar mediante transcripción in vitro (kit de síntesis de ARN de alto rendimiento T7, NEB n.º E2040) utilizando un análogo de capuchón (análogo de estructura de capuchón de ARN ARCA 3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G, NEB n.º S1411) o mediante capuchón enzimático con la enzima de capuchón de Vaccinia (NEB n.º M2080). P: Quiero usar la ARNm Cap 2'-O-metiltransferasa con el sistema de capuchón de Vaccinia (NEB n.º M2080) en una reacción de un solo paso para producir ARN cap 1. ¿Es posible? R: Sí, la ARNm Cap 2'-O-metiltransferasa se puede usar simultáneamente con la enzima de capuchón de Vaccinia en una reacción de un solo paso. Esto implica el capuchón y la metilación del ARN en la misma reacción. La enzima capping de Vaccinia añade la caperuza m7G en el extremo 5' del ARN para producir ARN caperuzado. La 2'-O-metiltransferasa utiliza este ARN como sustrato y añade un grupo metilo en la posición 2'-O del primer nucleótido transcrito para producir ARN cap-1. Consulte la sección del protocolo para la configuración de la reacción. P: ¿Qué precauciones se deben tomar al utilizar la ARNm Cap 2'-O-metiltransferasa? R: Es importante asegurarse de que el ARN que se utiliza en la reacción esté libre de sales y EDTA. Preferiblemente, debe resuspenderse en agua libre de nucleasas. Recomendamos encarecidamente el uso de guantes y tubos, puntas de pipeta y reactivos libres de nucleasas para evitar la contaminación por ARNasas. Se puede utilizar el inhibidor de ARNasa (NEB# M0314) en la reacción para evitar la degradación causada por ARNasas contaminantes. P: ¿Qué son Cap-0 y Cap-1? R: Cap-0 es una guanosina N7-metil unida al nucleótido 5' mediante un enlace trifosfato 5'-5', comúnmente conocido como m7G cap o m7Gppp- en la literatura. En la célula, la estructura Cap-0 es esencial para la traducción eficiente del ARNm que porta la cap. Una metilación adicional en la posición 2'O del nucleótido iniciador genera Cap-1, también conocido como m7GpppNm-, donde Nm representa cualquier nucleótido con metilación 2'O. Se ha demostrado que Cap-1 es importante para evadir la respuesta inmunitaria innata celular in vivo. P: ¿Puede la enzima capping de vaccinia (NEB n.° M2080) utilizar análogos de cap en la reacción de capping? R: No. La enzima capping de vaccinia utiliza GTP y SAM para generar una estructura cap en el ARN trifosfato 5', típicamente una transcripción sintética generada por transcripción in vitro. Por otro lado, los análogos de capuchón, como GpppG (NEB #S1407), m7GpppG (NEB #S1404), m7GpppA (NEB #S1405S) y el análogo de capuchón anti-reverso (ARCA; NEB #S1411) se utilizan durante la transcripción in vitro, donde el análogo de capuchón se incorpora directamente a la transcripción como el primer nucleótido en el extremo 5'.