New England Biolabs, M0367S, mezcla maestra de ligasa Blunt/TA

Blunt/TA Ligase Master Mix ligará estos sustratos: Categorías relacionadas ADN Ligasas Aplicaciones Clonación Ligación Especificaciones Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: Mis transformaciones usando reacciones Blunt/TA Ligase Master Mix no produjeron colonias. ¿Qué sucedió? R: La falta de colonias después de la transformación a menudo no es indicativa de una ligadura fallida. Las células competentes varían mucho en su eficiencia. El uso de células competentes de alta eficiencia puede hacer una diferencia dramática en el éxito percibido de una ligadura. Además, la integridad del ADN utilizado puede influir fuertemente en el resultado. Por ejemplo, una cantidad mínima de exonucleasa presente en una muestra de ADN antes de la ligadura puede masticar un saliente e impedir la ligadura de extremos compatibles. Además, las sales sobrantes de los pasos de purificación pueden inhibir o disminuir la eficiencia de la ligadura. Los extremos de ADN que se unirán deben ser compatibles con al menos un compañero que contenga un fosfato 5'. El ADN generado a partir de PCR necesita emplear cebadores fosforilados durante la síntesis o ser tratado con una quinasa después de la síntesis. El ADN preparado por digestión con enzimas de restricción mantiene la fosforilación 5'. Los extremos romos se pueden unir a cualquier otro extremo romo, mientras que los fragmentos con salientes necesitan aparearse correctamente para ser ligados. P: ¿Puede usarse la mezcla maestra Blunt/TA Ligase para la ligadura de fragmentos de extremo pegajoso? R: Sí. La mezcla maestra Blunt/TA Ligase ha sido optimizada para la ligadura de extremos romos y salientes de una sola base. La ligadura de fragmentos de extremo pegajoso, una reacción que procede con mayor eficiencia, también se puede lograr con este producto. La mezcla maestra Blunt/TA Ligase mejora los rendimientos para los extremos que típicamente reaccionan lentamente. Rendimientos del producto de ligadura final para todas las condiciones de reacción utilizando alta concentración de T4 DNA Ligase (NEB #M0202), el Quick Ligation Kit (NEB #M2200) y la mezcla maestra Blunt/TA (NEB #M0367). Los sustratos de Nick, extremo cohesivo y saliente de una sola base 3' se incubaron durante 15 minutos; el saliente de una sola base 5' se incubó durante 1 hora. P: ¿Se puede usar directamente la reacción de ligadura producida por la mezcla maestra Blunt/TA Ligase para transformar células electrocompetentes? R: No. No recomendamos usar reacciones de ligadura que contengan la mezcla maestra Blunt/TA Ligase para transformar células electrocompetentes. El ADN debe purificarse antes de su uso en electroporación. P: El volumen recomendado para una reacción con la mezcla maestra Blunt/TA Ligase es de 10 µl. Prefiero preparar mis reacciones de ligadura en un volumen de 20 µl. ¿Puedo aumentar la escala de la reacción? R: Sí. Siempre que la concentración de la mezcla maestra Blunt/TA Ligase en la reacción sea 1X (o el 50 % del volumen total de la reacción), se puede aumentar la escala de la reacción de ligadura. P: Suelo usar más de 5 µl de mis reacciones de ligadura para transformar alícuotas de 50 µl de células competentes. Cuando hago esto con la mezcla maestra Blunt/TA Ligase, mis placas de transformación tienen muy pocas colonias. ¿Cuál cree que es el problema? R: No recomendamos usar más de 5 ul de la mezcla maestra Blunt/TA Ligase para transformar 50 ul de células competentes. En algunos casos, hemos observado una disminución en la eficiencia de la transformación al usar más de 5 ul de la mezcla maestra Blunt/TA Ligase. El ADN con extremos compatibles, intactos y presentes en las cantidades especificadas por el protocolo, debe ligarse con la mezcla maestra Blunt/TA Ligase. No es necesario usar más de 5 ul en una reacción de transformación estándar. P: ¿Puedo incubar la mezcla maestra Blunt/TA Ligase durante más de 15 minutos? R: Sí. Sin embargo, nuestras pruebas revelaron que tiempos de incubación más prolongados no producen más transformantes. Tenga en cuenta que no recomendamos incubaciones durante la noche, ya que las transformaciones de las ligaduras incubadas durante la noche resultan en una disminución drástica del número de transformantes. P: ¿Puedo incubar la mezcla maestra Blunt/TA Ligase a una temperatura distinta a 25 °C? R: Sí. Puede incubar reacciones a 16 °C o 4 °C. P: Mi mezcla maestra de ligasa Blunt/TA se ha congelado en mi congelador. ¿Es esto un problema? R: No. Hemos probado la estabilidad del producto después de la congelación. Las pruebas de descongelación libre han confirmado que el rendimiento después de 20 ciclos de congelación/descongelación es cercano al de la mezcla líquida original. Si el producto se congela en su congelador, es probable que la temperatura interna sea inferior a los -20 °C esperados. P: El protocolo para la mezcla maestra de ligasa Blunt/TA indica que la reacción no debe inactivarse por calor. ¿Cómo puedo inactivar la actividad de ligación? R: Normalmente no es necesario inactivar las reacciones de ligación Blunt/TA. La reacción puede usarse directamente para la transformación con células químicamente competentes, o el ADN puede limpiarse mediante precipitación con etanol, purificación en gel o cualquier columna o perlas de purificación de ADN adecuadas para separar el producto de la ligación de la actividad enzimática y otros componentes de la reacción. Si desea detener la reacción sin limpieza, puede agregar un volumen igual de 50 mM de EDTA y mezclar con pipeta; sin embargo, esto interferirá con las reacciones posteriores que requieren magnesio u otros cationes divalentes.