New England Biolabs, M0368S, transcriptasa inversa ProtoScript® II

Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones Amplificación dependiente de helicasa,, Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 10 minutos a 37 °C utilizando poli(rA)•oligo(dT) 18 como plantilla. Condiciones de reacción Tampón de reacción de transcriptasa inversa ProtoScript® II 1X Incubar a 42 °C Tampón de reacción de transcriptasa inversa ProtoScript® II 1X Tris-HCl 50 mM KCl 75 mM MgCl2 3 mM (pH 8,3 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 20 mM NaCl 100 mM DTT 1 mM EDTA 0,1 mM Glicerol al 50 % IGEPAL® CA-630 al 0,01 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Condiciones del ensayo de la unidad Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 6 mM, ditiotreitol 10 mM, IGEPAL CA-630 al 0,01 %, 0,5 mM dTTP, 0,4 mM poly(rA)•oligo(dT) 18 . Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre NEB# M0368 y NEB# M0253? R: M0368 es una transcriptasa inversa M-MuLV mutante con actividad de RNasa H reducida y mayor termoestabilidad. La enzima es activa hasta 50 °C, lo que proporciona mayor especificidad, mayor rendimiento de ADNc y un producto de ADNc de longitud completa. P: ¿Cuál es la temperatura de reacción óptima para la transcriptasa inversa ProtoScript II (M0368)? R: La transcriptasa inversa ProtoScript II es capaz de generar ADNc de más de 10 kb hasta 48 °C. Recomendamos 42 °C para la transcripción inversa de rutina. P: ¿Se pueden utilizar los productos de ADNc en el análisis de PCR en tiempo real? R: Sí. Los productos de ADNc generados por la transcriptasa inversa ProtoScript II se pueden utilizar directamente para el análisis de PCR en tiempo real. P: ¿Qué ADN polimerasa termoestable se puede utilizar para PCR después de la síntesis de ADNc? R: Para PCR downstream, recomendamos OneTaq 2X Master Mix (NEB #M0482 o M0485) para detección por PCR de hasta 5 kb, Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix (NEB #M0494) para la más alta fidelidad, o LongAmp Taq 2X Master Mix (NEB #M0287) para altos rendimientos de productos más largos. P: ¿Cómo se puede mejorar el rendimiento al utilizar la transcriptasa inversa ProtoScript II? R: Se puede utilizar una mayor cantidad de enzima hasta 1000 U por 20 ul de reacción de síntesis de ADNc y aumentar la concentración de dNTP hasta 1 mM. P: ¿Cómo se puede aumentar la longitud del producto generado por la transcriptasa inversa M-MuLV? R: La incubación a 42 °C puede relajar parte de la estructura secundaria del ARN, lo que permite que la transcriptasa inversa M-MuLV produzca productos más largos. P: ¿Es necesario el tratamiento con RNasa H antes de la amplificación por PCR? R: Para la mayoría de las reacciones de RT-PCR, no se requiere el tratamiento con RNasa H. Sin embargo, para algunos amplicones difíciles o ensayos sensibles, añada 2 U de RNasa H de E. coli a la reacción e incube a 37 °C durante 20 min. P: ¿Cuál es la diferencia entre la transcriptasa inversa Induro (NEB n.° M0681) y la transcriptasa inversa ProtoScript II (NEB n.° M0368)? R: Existen principalmente dos tipos de transcriptasas inversas (RT): las RT codificadas por retrovirus y las RT codificadas por intrones. Ambos tipos de RT comparten algunos dominios conservados y sintetizan ADN complementario a partir de un molde de ARN. Las RT más comunes y mejor caracterizadas derivan de retrovirus como el virus de la leucemia murina de Moloney (M-MuLV, MMLV), como la transcriptasa inversa ProtoScript II. Por el contrario, la transcriptasa inversa Induro es una RT codificada por intrones del grupo II que exhibe mayor termoestabilidad, procesividad más rápida y mejor tolerancia a los componentes de la reacción en comparación con las RT retrovirales. La transcriptasa inversa Induro es útil para la síntesis de ADNc a partir de transcripciones largas, ARN con estructuras secundarias fuertes y muestras de ARN con inhibidores. P: ¿Por qué tengo bajos rendimientos de ADNc? R: Hay varias causas para un bajo rendimiento de ADNc. Aquí hay algunas sugerencias para mejorar el rendimiento: Verifique la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante o BioAnalyzer (Agilent). El ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. El ARN debe tener una relación mínima A260/A280 de 1,7 o un número RIN mayor que 8. La precipitación con etanol seguida de un lavado con etanol al 70% puede eliminar contaminantes como EDTA y guanidinio. La precipitación con cloruro de litio puede eliminar polisacáridos. Un paso de purificación de ARN mediante kits de extracción de ARN o extracción con fenol/cloroformo puede eliminar proteínas contaminantes como las proteasas. Aumente la cantidad de ARN utilizado, especialmente si el ARN es poco abundante. P: ¿Cómo sé si mi ARN molde es de buena calidad? R: Un ARN intacto de alta pureza es esencial para la síntesis completa de ADNc. Una relación de absorbancia A260/A280 superior a 1,7 o un número RIN superior a 8 en un BioAnalyzer suele indicar ARN de alta calidad.