New England Biolabs, M0369S, ElectroLigase®

Categorías relacionadas con ElectroLigase: ADN ligasas, aplicaciones, clonación, ligación, especificación, inactivación por calor a 65 °C durante 15 minutos, preguntas frecuentes. P: Mis transformaciones con reacciones de ElectroLigase® no produjeron colonias. ¿Qué ocurrió? R: La ausencia de colonias después de la transformación no suele indicar un fallo en la ligación. La eficiencia de las células competentes varía considerablemente. El uso de células competentes de alta eficiencia puede marcar una diferencia significativa en la percepción de éxito de una ligación. Además, la integridad del ADN utilizado puede influir considerablemente en el resultado. Por ejemplo, una pequeña cantidad de exonucleasa presente en una muestra de ADN antes de la ligación puede reducir el exceso e impedir la ligación de extremos compatibles. Además, las sales sobrantes de los pasos de purificación pueden inhibir o disminuir la eficiencia de la ligación. Otros factores que afectan la transformación incluyen el requisito de que los extremos del ADN que se unirán sean compatibles con al menos un componente que contenga un fosfato 5'. El ADN generado por PCR debe emplear cebadores fosforilados durante la síntesis o ser tratado con una quinasa después de la síntesis. El ADN preparado mediante digestión con enzimas de restricción mantiene la fosforilación 5'. Los extremos romos se pueden unir a cualquier otro extremo romo, mientras que los fragmentos con salientes necesitan un correcto apareamiento de bases para ser ligados. P: ¿Se pueden usar las reacciones de ligadura configuradas con ElectroLigase® para la transformación de células químicamente competentes? R: Sí, las reacciones de ElectroLigase® no contienen nada que inhiba la transformación de células químicamente competentes. De hecho, funciona bastante bien, acercándose al 50% de la eficiencia de nuestra Blunt/TA Ligase Master Mix en análisis paralelos. P: ¿Necesito diluir la reacción de ElectroLigase® para usarla para transformar células electrocompetentes? R: No, las reacciones de ElectroLigase® se pueden usar, sin diluir, en procedimientos de electroporación. P: ¿Se pueden incubar las reacciones de ElectroLigase® durante más de 30 minutos? R: Sí, sin embargo, nuestras pruebas revelaron que la mayoría de las reacciones están casi completas a los 30 minutos, con cierta ventaja observada para la ligadura de extremos romos al llegar a los 60 minutos. Tenga en cuenta que no recomendamos una incubación durante la noche porque las transformaciones de ligaduras incubadas durante la noche con ElectroLigase® generalmente producen menos transformantes. P: ¿Puedo incubar una reacción de ligadura con ElectroLigase® a una temperatura diferente a 25 °C? R: Sí, se observó una ligadura productiva a temperaturas de prueba de 4 °C, 16 °C, 25 °C y 37 °C. Para mayor comodidad y un alto rendimiento, recomendamos una temperatura de incubación de 25 °C. P: Utilicé una reacción con ElectroLigase® para transformar células electrocompetentes y experimenté arcos eléctricos en mi muestra. ¿Qué sucedió? R: Las reacciones con ElectroLigase se han formulado para ser directamente compatibles con células electrocompetentes. Las pruebas en muchas muestras no revelan un problema utilizando las condiciones típicas de electroporación. Los arcos eléctricos durante la electroporación pueden ser causados ​​por una baja resistencia o una alta conductividad en la muestra. Los factores típicos que afectan la conductividad durante la electroporación son la temperatura de la muestra y la concentración de sal. Las células competentes deben mantenerse frías en hielo y se debe tener cuidado de que la cubeta utilizada no se caliente antes de ser sometida al campo eléctrico. Esto significa usar guantes y limpiar la cubeta con un paño Kimwipe solo si es necesario, teniendo cuidado de no calentar la muestra. El ADN utilizado en ligaduras con ElectroLigase debe estar limpio (por ejemplo, purificado en columna) y suspendido en una solución acuosa con baja fuerza iónica (10 mM Tris o menos es aceptable). Por último, las burbujas de aire atrapadas en la muestra pueden impedir el contacto de la muestra con ambos electrodos de la cubeta. Unos simples golpecitos de la cubeta en una mesa de trabajo, después de cargar la mezcla de ADN/células competentes, pueden ayudar a desalojar el aire atrapado.