New England Biolabs, M0370S, Mezcla maestra instantánea de ligasa de extremo pegajoso

¿Buscas formulaciones y variantes adicionales de la ADN ligasa T4? Categorías relacionadas ADN ligasas Aplicaciones Clonación Ligación,, Clonación rápida: Acelere sus flujos de trabajo de clonación con reactivos de NEB Especificación Inactivación por calor No Preguntas frecuentes P: ¿Necesito transformar las reacciones de la mezcla maestra de ligasa instantánea de extremos pegajosos inmediatamente? R: No. La eficiencia de la ligación/transformación no disminuye si las reacciones de ligación se mantienen a temperatura ambiente o a 4 °C durante unos minutos. No recomendamos incubaciones superiores a 1 hora. Si el ADN no se va a utilizar para la transformación en 1 hora, recomendamos almacenarlo a -20 °C. P: ¿Puede la reacción de ligación producida por la mezcla maestra de ligasa instantánea de extremos pegajosos usarse directamente para transformar células electrocompetentes? R: No. No recomendamos el uso de reacciones de ligación que contengan la mezcla maestra de ligasa instantánea de extremos pegajosos para la transformación de células electrocompetentes. El ADN debe purificarse antes de su uso en electroporación. P: El volumen recomendado para una reacción de Instant Sticky-end Ligase Master Mix es de 10 ul. Prefiero preparar mis reacciones de ligación en un volumen de 20 ul. ¿Puedo aumentar la escala de la reacción? R: Sí. Siempre que la concentración de Instant Sticky-end Ligase Master Mix en la reacción sea 1X (o el 50 % del volumen total de la reacción), puede aumentar la escala de la reacción de ligación. P: Suelo utilizar más de 5 ul de mis reacciones de ligación para transformar alícuotas de 50 ul de células competentes. Cuando hago esto con Instant Sticky-end Ligase Master Mix, mis placas de transformación tienen muy pocas colonias. ¿Cuál cree que es el problema? R: No recomendamos utilizar más de 5 ul de reacciones de ligación de Instant Sticky-end Ligase Master Mix para transformar 50 ul de células competentes. En algunos casos, hemos observado una disminución de la eficiencia de la transformación al utilizar más de 5 ul de una reacción de ligación de Instant Sticky-end Ligase Master Mix. El ADN con extremos compatibles, intactos y presentes en las cantidades especificadas por el protocolo, debe ligarse con la mezcla maestra instantánea de ligasa de extremos pegajosos. No es necesario usar más de 5 ul en una reacción de transformación estándar. P: ¿Se puede usar la mezcla maestra instantánea de ligasa de extremos pegajosos para la ligación de fragmentos con extremos romos o salientes de una sola base? R: Sí, pero la reacción dejará de ser instantánea. Se requiere un tiempo de incubación de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente para garantizar una ligación de alta eficiencia de extremos romos o salientes de una sola base. P: Mi mezcla maestra instantánea de ligasa de extremos pegajosos se ha congelado en el congelador. ¿Es esto un problema? R: No. Hemos probado la estabilidad del producto después de la congelación. Las pruebas de descongelación libre han confirmado que el rendimiento después de 20 ciclos de congelación/descongelación es similar al de la mezcla líquida original. Si el producto se congela en el congelador, es probable que la temperatura interna sea inferior a los -20 °C esperados. P: El protocolo de la mezcla maestra instantánea de ligasa de extremos pegajosos indica que la reacción no debe inactivarse por calor. ¿Cómo puedo inactivar la actividad de ligación? R: Normalmente no es necesario inactivar las reacciones de ligación de extremos pegajosos. La reacción puede usarse directamente para la transformación con células químicamente competentes, o el ADN puede purificarse mediante precipitación con etanol, purificación en gel o cualquier columna o microesferas de purificación de ADN adecuadas para separar el producto de la ligación de la actividad enzimática y otros componentes de la reacción. Si desea detener la reacción sin purificación, puede añadir un volumen igual de EDTA 50 mM y mezclar mediante pipeta. Sin embargo, esto interferirá con las reacciones posteriores que requieren magnesio u otros cationes divalentes.