New England Biolabs, M0371S, Fosfatasa alcalina de camarón (rSAP)

La fosfatasa alcalina de camarón (rSAP) es una fosfatasa alcalina termolábil purificada a partir de una fuente recombinante. Categorías relacionadas: Fosfatasas, Aplicaciones: Desfosforilación, Clonación de ARN, Especificación: Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que hidroliza 1 μmol de p-nitrofenil fosfato, PNPP (NEB n.° P0757) en un volumen total de reacción de 1 ml en 1 minuto a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón rCutSmart™ 1X Incubar a 37 °C Tampón rCutSmart™ 1X Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 25 mM MgCl2 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Peso molecular teórico: 54 kDa Condiciones de ensayo de la unidad Dietanolamina-HCl 1 M (pH 9,8), MgCl2 0,5 mM, fosfato de p-nitrofenilo 50 mM. Estas condiciones solo se utilizan para cuantificar la actividad enzimática. Preguntas frecuentes P: ¿Qué fosfatasa alcalina, Quick CIP, rSAP o fosfatasa antártica, funciona mejor? R: Quick CIP (NEB n.° M0525) es la mejor opción porque ofrece un protocolo rápido, no requiere aditivos y tiene una alta actividad específica. Se prefiere Quick CIP a la fosfatasa antártica porque no requiere zinc añadido ni ningún otro cofactor en el tampón de reacción. Como resultado, Quick CIP se puede añadir directamente a los digeridos con enzimas de restricción. Además, tras la inactivación térmica de esta enzima, no es necesario purificar el ADN del vector antes de la reacción de ligadura. P: El número de colonias que no contienen un inserto parece alto. ¿Cómo puedo saber si rSAP funcionó? R: rSAP es una enzima muy robusta y es raro que la desfosforilación no se complete prácticamente por completo. Se pueden utilizar los siguientes controles de transformación para diagnosticar este problema: Vector sin cortar: para comprobar la competencia celular y la resistencia a los antibióticos. Vector cortado y no ligado: para comprobar si hay vector sin cortar. Puede ser necesaria la purificación en gel (recomendamos el kit de extracción de gel de ADN Monarch, NEB n.° T1020) para eliminar el último 0,1 % del vector sin cortar. Vector cortado y ligado: para comprobar la integridad de los extremos y las condiciones de ligadura. Vector cortado, desfosforilado y ligado: para comprobar la desfosforilación. El número total de colonias debe ser inferior al 5 % del vector cortado y ligado. P: ¿Qué grupos fosfato eliminan la rSAP, la Quick CIP o la fosfatasa antártica (AnP)? R: La rSAP, la Quick CIP y la AnP, al igual que cualquier fosfatasa alcalina, eliminan los fosfatos de los extremos 5' y 3' del ADN y el ARN monocatenarios y bicatenarios, y también desfosforilan los dNTP. Las fosfatasas alcalinas (incluidas la rSAP, la Quick CIP y la AnP) no tienen actividad en las estructuras de la tapa 5' del ARN. P: ¿Es necesario purificar el ADN después del tratamiento con rSAP? R: No, siempre que la rSAP se inactive por calor a 65 °C durante 5 minutos antes de la ligadura. Sin embargo, si la reacción de desfosforilación se realiza directamente después de la digestión del ADN del vector, tanto la enzima de restricción como la rSAP deben inactivarse por calor. En este caso, siga las recomendaciones del fabricante para inactivar la enzima de restricción. P: ¿Qué tan estable es la rSAP en su tampón de almacenamiento a diferentes temperaturas? R: La rSAP recombinante ha mejorado significativamente su estabilidad en comparación con la SAP nativa. Temperatura –20 °C 25 °C 100 % de actividad >2 años >2 meses P: ¿Cuál es el efecto de los quelantes metálicos, el fosfato inorgánico y los análogos de fosfato en la actividad de la rSAP? R: Los quelantes metálicos, el fosfato inorgánico y los análogos de fosfato son inhibidores. P: ¿Cuál es el efecto de los agentes reductores en la actividad de la rSAP? R: Los agentes reductores, DTT o β-mercaptoetanol (β-ME), pueden disminuir la actividad de la rSAP: Agentes reductores Concentración Actividad DTT 0 mM 100 % 1 mM 88 % 5 mM 63 % 10 mM 46 % 50 mM 20 % β-ME 0 mM 100 % 5 mM 95 % 10 mM 78 % 20 mM 75 % La actividad de la rSAP se midió mediante el ensayo PNPP en tampón de reacción de rSAP 1X suplementado con cantidades variables de DTT o β-ME. La actividad se muestra como porcentaje de actividad en comparación con el control, que no contenía agentes reductores añadidos. P: ¿La Quick CIP, la rSAP o la fosfatasa antártica (AnP) desfosforilan las proteínas? R: Se puede usar Quick CIP, rSAP o AnP para desfosforilar proteínas; sin embargo, NEB recomienda usar la proteína fosfatasa Lambda (Lambda PP, catálogo NEB n.° P0753), una proteína fosfatasa dual con una especificidad muy amplia. P: ¿Se puede inactivar la rSAP por calor? R: Sí. Inactive la rSAP por calor durante 5 minutos a 65 °C. P: ¿Es necesario purificar el ADN después de una digestión de restricción y antes del paso de desfosforilación? R: Si las enzimas utilizadas en la digestión de restricción se pueden inactivar por calor, no se necesita un paso de purificación. Si las enzimas utilizadas no se pueden inactivar por calor, se recomienda un paso de limpieza entre la digestión de restricción y el paso de desfosforilación. P: ¿Es necesario purificar el ADN después de la digestión de restricción y antes del paso de ligación? R: Si utiliza el Kit de Desfosforilación Rápida (NEB n.° M0508), rSAP (NEB n.° M0371) o Fosfatasa Antártica (NEB n.° M0289), que se pueden inactivar por calor, no es necesario realizar una limpieza. Si la fosfatasa alcalina utilizada es CIP, que no se puede inactivar por calor, sí es necesario realizar una limpieza (con el Kit de Limpieza de PCR y ADN Monarch® NEB n.° T1030). P: ¿Las fosfatasas alcalinas son activas en los tampones NE? R: Quick CIP (NEB n.° M0525) y rSAP (NEB n.° M0371) son activos en todos los NEBuffers de enzimas de restricción r1.1, r2.1, r3.1 y en el tampón rCutSmart™ (NEB n.° B6004) y pueden añadirse directamente al ADN digerido. La fosfatasa antártica (NEB n.° M0289) requiere un alto contenido de zinc y su actividad es óptima a pH 6.0. La fosfatasa antártica puede utilizarse en los NEBuffers 1, 2, 3 o 4, así como en los exclusivos NEBuffers para EcoRI y BamHI, solo cuando se complementa con el tampón de reacción de fosfatasa antártica 10X hasta una concentración final de 1X. P: Problema de clonación: Demasiado ruido de fondo en el paso de transformación. R: En caso de que se presente un exceso de fondo en el paso de transformación, es importante determinar si se debe a una desfosforilación ineficiente o a un plásmido no digerido que se ha transferido de la digestión de restricción. Para determinar el origen del fondo, se deben añadir dos muestras de control en el paso de transformación: un vector sin ligasa y un vector desfosforilado con ligasa. Si el número de transformantes presentes en la muestra 1 es elevado, esto indica la presencia de plásmido sin cortar en el ADN del vector. Si el número de transformantes en la muestra 1 es muy bajo, pero el número de transformantes en la muestra 2 es elevado, esto indica una desfosforilación ineficiente. Si se determina que el problema es la desfosforilación, asegúrese de añadir la cantidad recomendada de fosfatasa por cada cantidad de sustrato recomendada. Además, asegúrese de incubar durante el tiempo y la temperatura recomendados. Recomendamos inactivar por calor las enzimas de restricción antes del paso de desfosforilación, si las enzimas de restricción utilizadas pueden inactivarse por calor. También recomendamos inactivar por calor la fosfatasa antes del paso de ligadura. Si la fosfatasa utilizada no puede inactivarse por calor, recomendamos una limpieza de la columna de ADN antes del paso de ligadura. Esto puede lograrse utilizando nuestro kit Monarch PCR & DNA Cleanup (5 µg) (NEB #T1030). P: ¿Podrían darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (rAlbúmina) en los tampones NE? R: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.