New England Biolabs, M0372L, UDG termolábil antártico

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de estructura Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para liberar 60 pmol por minuto de un oligonucleótido de ADN monocatenario de 47 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de uracilo en 30 minutos a 30 °C en un volumen de reacción total de 50 μl en tampón Thermopol II 1X. Condiciones de reacción 1X Paquete de tampón de reacción Taq estándar Incubar a 37 °C 1X Paquete de tampón de reacción Taq estándar Tris-HCl 10 mM KCl 50 mM MgCl2 1,5 mM (pH 8,3 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 50 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 50 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de UDG en los NEBuffers 1-4? A: Actividad de los tampones (%) Tampón de reacción Taq estándar 100 Tampón de reacción Taq Crimson 100 Tampón de reacción Taq LongAmp™ 100 Tampón de reacción OneTaq Stardand 100 Tampón de amplificación isotérmica 100 Tampón de reacción Thermopol 100 Tampón de reacción Taq Hot Start Epimark® 100 Tampón de reacción UDG de E. coli 100 Tampón de reacción I10x Pfu Turbo® Cx 100 Tampón de reacción Q5 100 Tampón HF Phusion™ 10 Tampón de reacción 5x Green GoTaq® 100 Tampón NE 1 25 Tampón NE 2 50 Tampón NE 3 50 Tampón NE 4 100 P: ¿UDG funcionará en el tampón de ligasa de ADN T4? R: Sí. UDG funcionará bien en el tampón de ligasa de ADN T4. P: ¿Cuál es el peso molecular de la UDG termolábil? R: El peso molecular de la UDG es de 24,6 kDa. P: ¿Es la UDG una proteína marcada? R: No. La UDG no es una proteína marcada. P: Veo que la UDG termolábil antártica funciona a 25-37 °C. ¿Conocen otra glicosilasa que funcione a temperaturas más altas? R: Sí. La UDG Afu (NEB# M0279) puede liberar uracilo de un ADN que lo contiene a 65 °C. P: ¿Libera la UDG uracilo del ADN monocatenario y de doble cadena? R: Sí. La UDG puede eliminar uracilos tanto del ADN monocatenario como del de doble cadena. P: ¿Corta la UDG el ARN? R: No, la UDG no debería actuar sobre un sustrato de ARN. El UDG evolucionó para reparar residuos dU en el ADN que pueden crearse mediante la desaminación de dC (evitando así la mutación de un par de bases C:G a T:A que ocurriría al replicarse la hebra U). P: ¿Se puede usar el UDG para eliminar dU de un oligonucleótido corto de 21 mer? ¿Es necesario espaciar los residuos dU de alguna manera especial para evitar problemas de escisión? R: El UDG debería funcionar bien en un oligonucleótido de 21 mer. El espaciado no es importante. P: ¿Existen recomendaciones específicas para el uso del UDG en ADN monocatenario? Los materiales en la web y la tarjeta de datos parecen describir las condiciones de uso con dsADN. R: El UDG funciona igual de bien en ssADN y dsADN, por lo que las recomendaciones de uso son las mismas para ambos tipos de sustratos. P: ¿El UDG termolábil antártico escindirá ADN con uracilo en forma de dúplex ARN-ADN? R: Sí. P: ¿Cuál es la diferencia entre el UDG y el UNG? R: Ambos nombres se refieren a la uracilo-ADN glicosilasa. P: ¿Cuánta UDG termolábil antártica debo añadir a una reacción de PCR para evitar la contaminación por arrastre? R: Normalmente, añadimos 0,5 ul de UDG termolábil antártica a 25 ul de reacción de PCR. P: ¿Cómo utilizo la UDG termolábil antártica para prevenir la contaminación por arrastre en las reacciones LAMP? R: La prevención de la contaminación por arrastre requiere dos partes: la incorporación de dUTP por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón, la escisión de esos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por una UDG. Para LAMP, las reacciones deben realizarse con una inclusión de ~50 % de dUTP mezclado con dTTP (p. ej., 1,4 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,7 mM de dTTP y dUTP) y debe utilizarse una ADN polimerasa Bst para una incorporación eficiente de dU sin una inhibición significativa de la reacción. Para la posterior destrucción de productos contaminantes, se recomienda encarecidamente el uso de UDG termolábil antártico en lugar del UDG de E. coli, más termoestable. Incluya 0,5 μL de UDG termolábil antártico por cada 25 μL de reacción LAMP y simplemente configure y ejecute sus reacciones LAMP con normalidad. La actividad de UDG durante la configuración y el calentamiento a 65 °C destruirá rápida y eficientemente cualquier producto contaminante. Si se requiere una descontaminación más rigurosa, se pueden añadir 10 minutos a 25 °C al inicio del flujo de trabajo. Para simplificar, se han incluido dUTP y UDG en una mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X actualizada con UDG y kit LAMP fluorescente. Kit LAMP/RT-LAMP fluorescente WarmStart (con UDG).