New England Biolabs, M0373L, T4 ARN ligasa 2, KQ truncado

La ARN ligasa T4 2, KQ truncada, liga el extremo 5' preadenilado del ADN o ARN al extremo 3' del ARN. Categorías relacionadas Ligadura de ARN, RT-PCR, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones Clonación de ARN, RT-PCR y síntesis de ADNc, PCR Especificación Definición de unidad 200 unidades se define como la cantidad de enzima necesaria para dar una ligadura del 80% de un ARN de 31 meros al extremo preadenilado de un ADN de 17 meros [Enlazador de clonación de miRNA universal (NEB #S1315)] en un volumen total de reacción de 20 μl en 1 hora a 25 °C. 5´-FAM- rArGrUrCrGrUrArGrCrCrUrUrUrArUrCrCrGrArGrArUrUr CrArGrCrArArUrA-3´ 5´-rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2-3´ Condiciones de reacción Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X Incubar a 25 °C Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 ml Tris-HCl 100 mM NaCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Peso molecular teórico: 71378,96 daltons Actividad específica 200.000 unidades/mg Condiciones de ensayo: Tampón de reacción de la ARN ligasa T4 1X suplementado con 10 % (p/v) de PEG PM 8000, 20 pmol de ARN marcado con 5'-FAM y 40 pmol de ADN ligado preadenilado. Tras una incubación a 25 °C durante 1 hora, el producto ligado se detecta en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15 %. Preguntas frecuentes: P: ¿Es la ARN ligasa T4 2, KQ truncada, diferente de la ARN ligasa T4 2, K227Q truncada? R: Sí. La ARN ligasa T4 2, KQ truncada, combina dos mutaciones en el sitio activo (R55K y K227Q) que mejoran el rendimiento de esta enzima en comparación con la ARN ligasa T4 2, truncada y la ARN ligasa T4 2, K227Q truncada. La ligación con la ARN ligasa T4 2, KQ truncada reduce los niveles de productos de ligación secundarios a niveles comparables a los de la ARN ligasa T4 2, K227Q truncada, a la vez que acumula los productos de ligación deseados a tasas similares a las de la ARN ligasa T4 2, truncada. P: ¿Existen diferencias en la eficiencia de ligación entre la ARN ligasa T4 2, KQ truncada, la ARN ligasa T4 2, 227Q truncada y la ARN ligasa T4 2, KQ truncada? R: En las pruebas NEB, las ligaduras con la ARN ligasa T4 2, K227Q truncada y la ARN ligasa T4 2, KQ truncada en sustratos idénticos muestran que la eficiencia de la ligadura alcanza los mismos puntos finales. Si bien la ARN ligasa T4 2, KQ truncada y la ARN ligasa T4 2, truncada requieren tiempos de incubación similares, la ARN ligasa T4 2, K227Q truncada puede requerir tiempos de incubación más largos para alcanzar el punto final de la reacción. P: ¿Qué puede ligar la ARN ligasa T4 2, KQ truncada? R: La ARN ligasa T4 2, K227Q truncada puede realizar las mismas ligaduras que la ARN ligasa T4 2, truncada (NEB n.° M0242). P: ¿El PEG estimula la eficiencia de la ligadura? R: El PEG 8000 estimula considerablemente la actividad de ligadura de T4 Rnl2tr K227Q. La estimulación máxima se observó con una concentración de PEG 8000 del 15 % (p/v). El PEG 4000 también es estimulante, con un efecto de concentración similar al del PEG 8000. P: ¿Cómo puedo aumentar la eficiencia de la ligadura? R: En general, un mayor tiempo de reacción, una menor temperatura de reacción y la concentración molecular producen reacciones de ligadura más completas. Los tiempos de reacción pueden prolongarse hasta 24 horas o más. Para ligaduras de más de 2 horas, incubamos habitualmente a menos de 16 °C. Algunos científicos informan que la ligadura se realiza en hielo (0 °C) durante 24 horas. Recomendamos el uso de PEG 4000 u 8000 hasta una concentración del 15 % (p/v). Aumentar aún más la concentración de PEG no aumentó la eficiencia de la ligadura. P: ¿Se puede utilizar la ARN ligasa T4 2, KQ truncada, en otros NEBuffers? R: Se observa una actividad óptima en su tampón único; sin embargo, la enzima es activa en los tampones NE 1 y 2. P: El peso molecular de la ARN ligasa T4 2, KQ truncado, es de 71,6 kDa. ¿Es una fusión? R: Sí. En nuestras pruebas, la fusión MBP y las enzimas sin etiquetar tienen el mismo rendimiento. P: ¿Está disponible el PEG 8000? R: El PEG 8000 se incluye como componente del tampón de reacción de la ARN ligasa T4 (NEB n.° B0216). P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? A: NEB # Tolerancia a la sal de la ligasa de ARN M0204 T4 ARN ligasa 1 (ligasa de ARNmc) ≤ 50 mM M0239 T4 ARN ligasa 2 (ligasa de ARNdc) ≤ 50 mM M0242 T4 ARN ligasa 2, truncada ≤ 100 mM M0351 T4 ARN ligasa 2, truncada K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 ARN ligasa 2, truncada KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligasa ≤ 50 mM E2610 Kit de adenilación 5' (ligasa Mth) ≤ 300 mM M0319 Ligasa de ADN/ARN termoestable 5' App ≤ 50 mM