New England Biolabs, M0374S, ADN polimerasa Bst 3.0®

¿Necesita ayuda para diseñar cebadores LAMP? Utilice las categorías relacionadas: Amplificación isotérmica y aplicaciones de desplazamiento de cadena, Amplificación del genoma completo, Amplificación isotérmica mediada por bucle, Especificación de la amplificación isotérmica. Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 25 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 65 °C. Condiciones de reacción 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica II Incubar a 65 °C 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica II 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 150 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Tween® 20 (pH 8,8 a 25 °C) Actividad en tampones NE Tampón de almacenamiento 100 mM KCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 0,1 % Triton® X-100 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 5 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM MgCl2, 30 nM ADN SS M13mp18, cebador de secuenciación M13 70 nM (–47) 24 mer, dATP 200 μM, dCTP 200 μM, dGTP 200 μM, dTTP 100 μM incluyendo [3H]-dTTP y 100 μg/ml de BSA. Preguntas frecuentes P: ¿Las ADN polimerasas NEB se suministran con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden pedir como una mezcla conveniente (mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB# N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (conjunto de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB# N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido). P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 3.0 en otros tampones NEB? R: Se observa una actividad óptima en el tampón de amplificación isotérmica II y un rendimiento casi óptimo en el tampón de amplificación isotérmica. Para otros tampones, recomendamos un pH de 7,5 a 10 y una sal monovalente de 50 a 250 mM. Actividad en otros tampones NEB: Tampón NE1.1: 10 % Tampón NE2.1: 100 % Tampón NE3.1: 100 % Tampón CutSmart: 100 % ThermoPol: 75 % Tampón de amplificación isotérmica: 90 %. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 3.0 para hacer que el ADN se vuelva romo? R: Los salientes 5' (extremos cóncavos 3') se pueden rellenar, pero los salientes 3' no se eliminarán porque la enzima carece de actividad exonucleasa. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB n.° M0210), la ADN polimerasa T4 (NEB n.° M0203) y el kit Quick Blunting™ (NEB n.° E1201) son las mejores opciones para crear productos de ADN romos. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 3.0 para rellenar los salientes 3'? R: No, las ADN polimerasas no pueden rellenar los salientes 3'. Para crear extremos romos, se deben eliminar los salientes 3'. La ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB n.° M0210), la ADN polimerasa T4 (NEB n.° M0203) y la nucleasa de frijol mungo (NEB n.° M0250) son las mejores opciones para eliminar los salientes 3'. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 3.0 para eliminar los salientes 5'? R: No, las ADN polimerasas no pueden eliminar los salientes 5'. Utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB n.º M0250) para eliminar los salientes 5'. P: ¿Se puede inactivar térmicamente la ADN polimerasa Bst 3.0? R: Sí, calentar a 80 °C durante 5 minutos. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst 3.0 en aplicaciones que requieren ciclado térmico? R: No, las temperaturas de reacción son demasiado altas para la estabilidad de la enzima. P: ¿Se puede iniciar la ADN polimerasa Bst 3.0 en una muesca del ADN? R: Sí, puede iniciar la síntesis de la cadena en una muesca utilizando el 3' OH como cebador. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst 3.0 en reacciones de marcaje y en reacciones de relleno parcial? R: Sí, también se recomienda el fragmento Klenow (3'→5' exo-) (NEB n.º M0212) para estas aplicaciones. P: ¿Se puede diluir la ADN polimerasa Bst 3.0? R: Sí, se puede diluir y almacenar en un tampón que contenga 100 mM de KCl. El tampón preferido es 100 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 0,1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0,1 % de Triton X-100 y 50 % de glicerol. También se puede utilizar el diluyente B (NEB n.º B8002S). P: ¿Tiene la ADN polimerasa Bst 3.0 actividad de transcriptasa inversa? R: Sí. Para su uso en aplicaciones de RT, recomendamos concentraciones elevadas de magnesio (4-8 mM). Para reacciones generales de RT-LAMP, recomendamos una transcriptasa inversa específica (WarmStart RTx, NEB n.º M0380) además de la ADN polimerasa dependiente de ADN; sin embargo, cuando se desea un sistema monoenzimático, la Bst 3.0 es la enzima de elección. P: ¿Incorpora la ADN polimerasa Bst 3.0 dUTP? R: Sí. La ADN polimerasa Bst 3.0 se puede utilizar con una mezcla de dUTP y dTTP o con la sustitución completa de dTTP por dUTP. El uso de dUTP al 100 % puede reducir los umbrales de amplificación en un 10 %. P: ¿Tiene la ADN polimerasa Bst 3.0 una exonucleasa correctora activa 3'→5'? R: No. Si necesita una polimerasa correctora, recomendamos la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB n.° M0210) para aplicaciones de baja temperatura y desplazamiento de cadena, o la ADN polimerasa Q5 (NEB n.° M0491) para una incorporación y PCR de máxima fidelidad. P: ¿Dispone NEB de una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP proporcionados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana. P: ¿Qué tan activo es Bst 3.0 a otras temperaturas? R: <45 °C: 10-25 % 45-55 °C: 75 % 55-72 °C: 100 % Bst 3.0 se puede usar hasta 75 °C, pero recomendamos 65-72 °C para un rendimiento óptimo. P: ¿Cómo puedo reducir la amplificación sin molde (NTC) en las reacciones LAMP con Bst 3.0? R: La forma más eficaz de eliminar la amplificación sin molde de las reacciones LAMP es usar un conjunto de cebadores diferente para el amplicón, y recomendamos cribar de 2 a 3 conjuntos de cebadores LAMP para cualquier diana nueva. Pero si el diseño del cebador está definido y se observa una amplificación sin molde, la temperatura de la reacción LAMP con Bst 3.0 puede elevarse hasta 72 °C. Esta temperatura más alta generalmente reduce o elimina el NTC. Una tercera opción es reducir la concentración de Mg en la reacción. 8 mM de Mg suele ser la mejor opción para el rendimiento de LAMP, pero para algunos objetivos, la amplificación sin molde puede reducirse utilizando 5-6 mM de Mg. P: ¿Cómo se utiliza la UDG termolábil antártica para la prevención de contaminación por arrastre en las reacciones LAMP? R: La prevención de la contaminación por arrastre requiere dos partes: la incorporación de dUTP por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón, la escisión de esos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por una UDG. Para LAMP, las reacciones deben ejecutarse con una inclusión de ~50% de dUTP mezclado con dTTP (p. ej., 1,4 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,7 mM de dTTP y dUTP) y debe utilizarse una ADN polimerasa Bst para una incorporación eficiente de dU sin inhibición significativa de la reacción. Para la posterior destrucción de productos contaminantes, se recomienda encarecidamente el UDG termolábil antártico en lugar del UDG de E. coli, más termoestable. Incluya 0,5 μL de UDG termolábil antártico por cada 25 μL de reacción LAMP y simplemente configure y ejecute sus reacciones LAMP de forma normal. La actividad del UDG durante la configuración y el calentamiento a 65 °C destruirá rápida y eficientemente cualquier producto contaminante. Si se requiere una descontaminación más rigurosa, se pueden añadir 10 minutos a 25 °C al inicio del flujo de trabajo. Para simplificar, se han incluido dUTP y UDG en una versión actualizada: WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix con UDG y kit LAMP fluorescente WarmStart Fluorescent LAMP/RT-LAMP Kit (con UDG). P: ¿Cuáles son las principales causas de fallo de reacción utilizando la ADN polimerasa Bst 3.0? R: Las temperaturas inferiores a 50 °C o superiores a 72 °C pueden reducir significativamente la actividad enzimática. Además, no utilizar el tampón adecuado que contiene 50–150 mM KCl, 2–15 mM Mg, o un pH fuera del rango de pH 7,5–10 causa fallo de reacción. Consulte la actividad en otros tampones más arriba. P: ¿Qué es LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipo sofisticado. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP funcionando como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande, Bst 2.0, Bst 3.0 y la ADN polimerasa Bst-XT? R: Las cuatro polimerasas son ADN polimerasas moderadamente termoestables con actividad de desplazamiento de cadena, lo que les permite realizar reacciones de amplificación isotérmica como LAMP. La ADN polimerasa Bst 2.0 es un homólogo diseñado in silico de la ADN polimerasa Bst, Fragmento Grande. Está diseñada para mejorar las propiedades en las reacciones LAMP, incluyendo la tolerancia a la sal, la termoestabilidad y la incorporación de dUTP. La Bst 2.0 destaca por su alta especificidad. La Bst 3.0 ofrece algunas mejoras, entre las que destaca una mayor velocidad de amplificación. La Bst 3.0 también ha mejorado su rendimiento en reacciones LAMP a temperaturas más altas (hasta 72 °C); sin embargo, para algunos objetivos, la Bst 3.0 no conserva la alta especificidad de la Bst 2.0. Bst-XT combina las propiedades más deseables de Bst 2.0 y Bst 3.0. Ofrece la alta especificidad de Bst 2.0 y la rápida velocidad de amplificación de Bst 3.0. Bst-XT también es activo en un rango de temperatura más amplio, lo que permite reacciones LAMP entre 50 y 70 °C. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 Velocidad de amplificación ★★★★★ ★★★★ ★★★★★ Especificidad ★★★★★ ★★★★★ ★★ ¿Configuración a temperatura ambiente? Activado Activado No recomendado Temperatura óptima de LAMP 50-70 °C 60-70 °C 55-72 °C Disponible sin glicerol Sí NEB #M9205 Sí NEB #M0402 Sí NEB #M0443 ★★★★★ = producto óptimo recomendado para la aplicación seleccionada ★★ o ★★★ = realizará la aplicación seleccionada ★ = puede funcionar pero no se recomienda P: Cuando descongelo el tampón de amplificación isotérmica II veo mucho precipitado blanco, ¿es esto normal? R: Sí. Debido a la alta concentración de sales (MgSO4, KCl) en el tampón de amplificación isotérmica II 10X, es común que haya precipitación durante los ciclos de congelación/descongelación. Esta volverá fácilmente a la solución con el vórtex, y el tampón debe agitarse completamente con vórtex antes de su uso. P: ¿Cuándo debería elegirse la ADN polimerasa Bst 3.0? R: La ADN polimerasa Bst 3.0 presenta una alta actividad de desplazamiento de cadena. Cubre un vacío entre las polimerasas termófilas y mesófilas. La temperatura óptima de 60-72 °C es mayor que la de la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) e inferior a la de la ADN polimerasa Vent (NEB# M0254), otras dos polimerasas con desplazamiento de cadena. Esto ofrece a los investigadores un rango más amplio de condiciones de reacción para optimizar el desplazamiento de cadena y la hibridación de cebadores. Esto resulta útil en el diseño de estrategias de secuenciación, así como en tecnologías de amplificación isotérmica, y la Bst 3.0 es la enzima más rápida y robusta para métodos isotérmicos como LAMP. Presenta una mayor tolerancia a los inhibidores de las muestras de diagnóstico, lo que permite reacciones más consistentes con menor preocupación por la limpieza. La Bst 3.0 presenta una alta actividad de transcriptasa inversa hasta 72 °C, lo que permite reacciones RT-LAMP monoenzimáticas y la síntesis de ADNc a través de estructuras secundarias complejas. P: ¿Por qué debería usar la ADN polimerasa Bst 3.0? R: La ADN polimerasa Bst 3.0 amplía todas las propiedades mejoradas de la ADN polimerasa Bst 2.0. La Bst 3.0 proporciona los tiempos de amplificación más rápidos para métodos de diagnóstico como LAMP, es significativamente más tolerante a los inhibidores de la amplificación y es la enzima recomendada para muestras impuras o detección directa. Si se utiliza una diana de ARN, se recomienda usar la Bst 3.0, ya que posee el mayor nivel de actividad de transcriptasa inversa y puede realizar reacciones RT-LAMP monoenzimáticas.