New England Biolabs, M0375S, ligasa SplintR®

Categorías relacionadas con SplintR Ligación de ARN, Ligasas de ADN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Agua libre de nucleasas (NEB n.° B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para ligar (hasta un 50 % de finalización) 2 picomoles de un sustrato híbrido de ADN:ARN marcado con FAM tripartito en una reacción de 20 μl a 25 °C en 15 minutos en tampón de reacción de ligasa SplintR 1X. Condiciones de reacción 1X tampón de reacción de ligasa SplintR Incubar a 25 °C 1X tampón de reacción de ligasa SplintR 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM ATP 10 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 300 mM NaCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 20 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Puede decirme qué inhibe la ligasa SplintR? R: La ligasa SplintR está activa entre 4 y 37 °C. Por encima de esta temperatura, la enzima comienza a desnaturalizarse. Se inactiva principalmente después de 10 minutos a 65 °C. Además, los cationes monovalentes como NaCl y KCl inhiben la enzima. Estos componentes deben mantenerse por debajo de 50 mM en la reacción. Suministramos la enzima en NaCl 300 mM para mantener una actividad robusta durante su vida útil a -20 °C, pero la enzima debe diluirse mediante la adición a la reacción. Esto se logra fácilmente eligiendo una dilución de 20 veces en la configuración de la reacción (por ejemplo, 1 ul de enzima en una reacción de 20 ul). Como con la mayoría de las enzimas, debe evitarse la presencia de detergentes iónicos y desnaturalizantes, como SDS, urea y guanidina HCl. P: ¿Puede usarse SplintR® DNA Ligase para métodos basados ​​en ligación de detección de microARN? R: Sí, se ha demostrado que SplintR DNA Ligase es adecuada para la detección de microARN mediante la reacción de detección de ligasa acoplada a qPCR y para la detección utilizando sondas Padlock circularizables. La ligasa SplintR supera la limitación de eficiencia de la ligasa de ADN T4 para la detección de ARN in vitro o in situ directa mediante ligación, lo que la convierte en una herramienta atractiva para la detección y cuantificación de microARN. P: ¿Cómo puedo maximizar la fidelidad de la ligación al usar la ligasa de ADN SplintR? R: Se ha demostrado que aumentar la temperatura de reacción mejora la actividad y la especificidad de la ligasa de ADN SplintR. La incubación a 37 °C proporciona mejores resultados en la detección de microARN. También se ha demostrado que la adición de ET SSB (NEB n.° M2401S) aumenta la actividad y reduce la ligación inespecífica al ligar sondas de ADN a ARN con la ligasa de ADN SplintR. Consulte la página del producto de la ligasa de ADN SplintR para obtener referencias. P: Me gustaría usar la ligasa SplintR en un flujo de trabajo, pero no usar el tampón de reacción proporcionado. ¿Podrían indicarme qué componentes del tampón de reacción necesito? R: Recomendamos una reacción con un agente tampón de 20-50 mM a un pH entre 7,5 y 8,0. Además, el magnesio debe estar presente a ≥ 5 mM para una actividad máxima. El manganeso no es necesario, pero observamos un aumento en la actividad cuando este catión divalente está presente por encima de 5 mM. El ATP es necesario, pero la enzima es activa en un amplio rango de concentraciones (10 nM-1 mM). P: La ligasa SplintR parece muy concentrada a 25 unidades por microlitro. ¿Cómo sé cuánto añadir a mi reacción? R: La ligasa SplintR se ha desarrollado para la comunidad de ciencias de la vida, con un fuerte reconocimiento por su utilidad como reactivo de detección. Es probable que sea necesaria cierta optimización empírica para aplicaciones individuales. Empleamos un ensayo muy sensible, en el que el sustrato está presente en cantidades nanomolares. Como tal, la definición de la unidad está dirigida a aplicaciones donde se emplean rutinariamente cantidades de sustrato de un solo nanogramo. La enzima se suministra como una solución de 10,5 uM. Sugerimos mantener la enzima por debajo de 1 uM en la reacción con un rango sugerido de 100 nM a 1 uM. Para muchas aplicaciones, comenzar con un exceso de enzima de 2 veces sobre los extremos ligables es ideal. Además, si la reacción no avanza tan eficientemente como se desea, recomendamos encarecidamente extender el tiempo de incubación en lugar de aumentar la cantidad de enzima en la reacción. P: ¿Cuál es la tolerancia a la sal de esta ARN ligasa? R: NEB # ARN ligasa Tolerancia a la sal M0204 T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa) ≤ 50 mM M0239 T4 ARN ligasa 2 (dsRNA ligasa) ≤ 50 mM M0242 T4 ARN ligasa 2, truncada ≤ 100 mM M0351 T4 ARN ligasa 2, truncada. K277Q ≤ 100 mM M0373 T4 ARN ligasa 2, trunc. KQ ≤ 100 mM M0375 SplintR Ligasa ≤ 50 mM E2610 5' Adenylation Kit (Mth Ligasa) ≤ 300 mM M0319 Thermostable 5' App ADN/ARN Ligasa ≤ 50 mM P: ¿Qué tipo de extremos une la SplintR Ligasa? R: La SplintR Ligasa es extremadamente eficaz en el sellado de mellas entre residuos adyacentes de cadenas de ADN hibridadas a férulas o puentes de ARN, con una eficiencia a menudo 10-100 veces mayor que la observada para la T4 ADN ligasa. En un sustrato completamente de ADN, esta actividad de sellado de mellas es equivalente a otras ADN ligasas. No es una buena opción para flujos de trabajo de clonación molecular en los que es necesario reparar roturas de doble cadena (como unir un vector y un inserto).