New England Biolabs, M0378S, ARN polimerasa T3

La ARN polimerasa del bacteriófago T3 es una ARN polimerasa dependiente del ADN que es altamente específica para el promotor del fago T3. Categorías relacionadas Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN Especificación de PCR Materiales necesarios pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB #M0314) (opcional) Mezcla de solución de ribonucleótidos (NEB #N0466) DTT fresco (opcional) Agua libre de nucleasas (NEB #B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima requerida para incorporar 1 nmol de ATP en un material insoluble en ácido en 1 hora a 37 °C. Condición de reacción Tampón de reacción 1X RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada ATP, UTP, GTP, CTP y plantilla de ADN que contiene el promotor de la ARN polimerasa T3. Incubar a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción 1X RNAPol Tampón de reacción 1X 40 mM Tris-HCl 6 mM MgCl2 1 mM DTT 2 mM espermidina (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 1 mM EDTA 20 mM 2-mercaptoetanol 0,1 % Triton® X-100 50 % (p/v) Glicerol pH 7,9 a 25 °C Condiciones del ensayo de la unidad Tampón de reacción 1X RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y 2 μg de ADN T3 en 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la secuencia promotora de la ARN polimerasa T3? A: Promotor T3 5′ AATTAACCCTCACTAAAG 3′ La ARN polimerasa T3 inicia la transcripción en la G subrayada de la secuencia promotora. Luego, la polimerasa transcribe usando la cadena opuesta como molde de 5´→3´. La primera base del transcrito será una G. P: ¿La reacción de transcripción con la ARN polimerasa T3 requiere un cebador? R: No, la ARN polimerasa T3 reconoce su secuencia promotora específica e inicia la transcripción en la G final. Luego, la polimerasa transcribe usando la cadena opuesta como molde de 5´→3´. P: ¿La ARN polimerasa T3 deja una base extra al final de un transcrito? R: Sí, la ARN polimerasa T3 puede añadir una o unas cuantas bases extra al final de un transcrito produciendo un conjunto de transcripciones con extremos 3´ heterogéneos. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa T3 con ADN plasmídico sin cortar? R: Sí, pero la ARN polimerasa T3 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Se puede producir ARN aberrante al usar la ARN polimerasa T3? R: Se ha observado ARN aberrante cuando la enzima de restricción utilizada para linealizar el plásmido aguas abajo del ADN de interés produce un saliente 3'. Para evitar esto, el plásmido debe cortarse con una enzima de restricción que deje un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Puedo usar la ARN polimerasa T3 para crear sondas radiomarcadas de alta actividad específica? R: Sí, se pueden usar la ARN polimerasa 3, la ARN polimerasa SP6, la ARN polimerasa T7 y el kit HiScribe T7 (NEB n.° E2040) para crear sondas de ARN. Se puede obtener una mayor sensibilidad de detección de ácidos nucleicos utilizando una sonda de ARN debido a la mayor estabilidad de los híbridos ARN/ADN que los híbridos ADN/ADN. P: ¿Cuáles son las principales causas del fallo de la reacción utilizando la ARN polimerasa T3? R: La ARN polimerasa T3 es extremadamente sensible a la inhibición de la sal. La concentración de sal monovalente no debe superar los 20 mM. La plantilla de ADN debe prepararse sin sal. La contaminación por ARNasa degradó el producto de ARN. Recomendamos utilizar el inhibidor de ARNasa (NEB n.º M0314 o n.º M0307) en la reacción a 1 unidad/ul. Utilice agua ultrapura y asegúrese de que la plantilla de ADN haya sido extraída con fenol/cloroformo. P: ¿Por qué es baja la actividad específica de la sonda? R: La concentración del nucleótido radiactivo debe ser limitante (6 μM). En otras palabras, si se utiliza ATP marcado, se agregan 500 μM de UTP, CTP y GTP, pero solo 6 μM de ATP en la transcripción para que el ATP se incorpore en un porcentaje mayor, lo que da como resultado una sonda de ARN muy caliente.