New England Biolabs, M0379S, Exonucleasa VII

Categorías relacionadas Exonucleasas y endonucleasas no específicas Especificación Unidad Definición Una unidad se define como la cantidad de enzima que catalizará la liberación de 1 nmol de nucleótido soluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 30 minutos a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de exonucleasa VII 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción de exonucleasa VII 50 mM Tris-HCl 50 mM Fosfato sódico 8 mM 2-mercaptoetanol 10 mM (pH 8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Glicerol al 50 % Tris-HCl 50 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM NaCl 0,1 M Triton® X-100 al 0,1 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 95 °C durante 10 minutos Condiciones del ensayo unitario Tampón de reacción de exonucleasa VII 1X que contiene 0,15 mM de ADN de E. coli monocatenario sonicado [3H]. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la actividad de la exonucleasa VII en los siguientes tampones? A: Actividad de los tampones (%) Tampón de reacción Taq estándar 100 Tampón de reacción Taq Crimson 50 Tampón de reacción Taq LongAmp® 100 Tampón de reacción OneTaq® Stardand 100 Tampón de amplificación isotérmica 75 Tampón de reacción Thermopol® 75 Tampón de reacción Taq Hot Start Epimark® 100 Tampón de reacción Q5® 75 Tampón de reacción Q5 + potenciador 60 Tampón de ligasa de ADN T4 50 Tampón HF Phusion™ 90 Tampón de reacción GoTaq® verde 25 Tampón NE 1 10 Tampón NE 2 75 Tampón NE 3 75 Tampón NE 4 75 Cutsmart™ 75 P: ¿Funcionará la exonucleasa VII en un tampón de PCR? R: Sí. La exonucleasa VII funciona bien en la mayoría de los tampones de PCR, como se muestra en la siguiente tabla. P: ¿Cuál es el peso molecular de la exonucleasa VII? R: La subunidad grande tiene 51,8 kDa y la subunidad pequeña tiene 8,8 kDa. P: ¿Es la exonucleasa VII una proteína marcada? R: No. La exonucleasa VII no es una proteína marcada. P: ¿La exonucleasa VII corta el ARN? R: No, la exonucleasa VII no debería actuar sobre un sustrato de ARN. P: ¿Se puede despuntar el ADN con la exonucleasa VII? R: No, los extremos cortos de 4 pb o menos no son buenos sustratos. Utilice la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) para rellenar los salientes 5' (también llamados extremos cóncavos 3') y reabsorber los salientes 3', o utilice la nucleasa de frijol mungo (NEB# M0250) para reabsorber los salientes 3' o 5'. Nota: Los salientes 3' no se pueden rellenar. P: ¿Cuál es la diferencia entre la exonucleasa VII y la exonucleasa I (NEB# M0293)? R: La exonucleasa VII puede degradar el ssADN en ambas direcciones, a diferencia de la exonucleasa I, que solo actúa en la dirección 3'-5'. La exonucleasa VII también puede degradar oligos de ssADN fosforotioados en los extremos 5' y 3'. La exonucleasa I se bloquea en presencia de fosforotioatos en el extremo 3'. P: ¿Cómo se eliminan los cebadores de una reacción de PCR? R: En un protocolo típico, mezclamos 5 µl de productos de PCR y 2 µl de exonucleasa VII, seguido de una incubación a 37 °C durante 30 min y a 95 °C durante 10 min.