New England Biolabs, M0380S, Transcriptasa inversa WarmStart® RTx

Este producto está disponible en Categorías relacionadas RT-PCR,, Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas Aplicaciones Amplificación por desplazamiento de cadena y mellado Enzima,, Síntesis de ADNc,, Transcripción inversa (síntesis de ADNc), Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de dTTP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 20 minutos a 50 °C utilizando poli(rA)•oligo(dT)18 como plantilla. Condiciones de reacción 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica 1X Paquete de tampón de amplificación isotérmica 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 50 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Tween® 20 (pH 8,8 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 100 mM KCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 10 minutos Condiciones del ensayo de la unidad 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM (NH4)2SO4, 50 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween-20, 0,5 mM dTTP, 0,4 mM poly(rA)•oligo(dT)18. Preguntas frecuentes P: El tamaño del producto se enumeraba anteriormente en Reacciones y ahora se enumera en Unidades. ¿Qué ha cambiado? R: Para estandarizar el tamaño del producto y proporcionar flexibilidad de uso, hemos cambiado el tamaño del producto para que se enumere en términos de Unidades. Esto dará como resultado los siguientes cambios: M0380S: 50 Reacciones cambiadas a 400 Unidades M0380L: 250 Reacciones cambiadas a 2000 Unidades En ambos casos, el volumen del producto suministrado aumentó ligeramente para acomodar el cambio a Unidades. P: ¿Qué es LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin requerir equipo sofisticado. Utiliza una ADN polimerasa de desplazamiento de soporte, como una ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas de ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad de RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Qué ventajas ofrece WarmStart® RTx? R: Similar al uso de las ADN polimerasas de inicio en caliente, una transcriptasa inversa de inicio en caliente permite un rendimiento constante en las reacciones de amplificación. Con la propiedad WarmStart®, cualquier reacción RT-LAMP con WarmStart RTx o ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart (NEB n.° M0538) puede configurarse a temperatura ambiente, sin amplificación inespecífica. Este control proporciona un mayor grado de especificidad a las reacciones de detección y amplificación de ARN, y permite flexibilidad en configuraciones de alto rendimiento o sin hielo. P: ¿Qué tan sensible es la amplificación de ARN con WarmStart® RTx? R: Las reacciones RT-LAMP de un solo paso con WarmStart RTx pueden proporcionar de forma rutinaria la amplificación de la diana con tan solo 1 pg de ARN de entrada. Las reacciones RT-PCR con WarmStart RTx o Hot Start Taq pueden proporcionar la amplificación de la diana con tan solo 10 fg de ARN de entrada. P: ¿Se puede inactivar WarmStart® RTx? R: Recomendamos calentar a 80 °C durante 10 minutos. P: ¿WarmStart® RTx es activo en otros tampones? R: Sí, WarmStart® RTx generalmente es activo en tampones con pH >7,5, 10-200 mM de sal monovalente y 2-20 mM de Mg₂. Actividad en otros tampones NEB: NEBuffer1.1: 10 % NEBuffer2.1: 75 % NEBuffer3.1: 75 % CutSmart™: 90 % ThermoPol™: 90 % P: ¿Cómo se utiliza WarmStart® RTx en RT-LAMP? R: Prepare una mezcla de 25 µL que contenga: 2,5 µL de tampón de amplificación isotérmica (1X), 6 mM de MgSO4 (8 mM en total), 1,4 mM de dNTP, 1,6 µM de FIP/BIP, 0,2 µM de F3/B3, 0,4 µM de LoopF/B, 8 U de Bst 2.0 WarmStart® o Bst 2.0®, 7,5 U de WarmStart® RTx Mix, colóquela directamente a 65 °C. P: ¿Cuál es la longitud máxima del producto de ADNc producido por WarmStart® RTx? R: WarmStart RTx se desarrolló para obtener el mejor rendimiento con amplicones cortos en reacciones de amplificación diagnóstica (p. ej., RT-LAMP y RT-PCR). Sin embargo, funciona bien en la síntesis de ADNc, con productos de hasta 5 kb. Para productos más largos, recomendamos ProtoScript® II (NEB #M0368) o el práctico kit de síntesis de ADNc de primera cadena ProtoScript II (NEB #E6560). Para los productos de ADNc más largos, recomendamos Induro® Reverse Transcriptase (NEB #M0681), una transcriptasa inversa codificada por intrones del grupo II. P: ¿Cómo se utiliza WarmStart® RTx para la síntesis de ADNc? R: Prepare una mezcla de 20 µL con: 2 µL de tampón de amplificación isotérmica (1X), 0,5 mM de dNTP, 6 µM de mezcla de cebadores aleatorios, 20 U de inhibidor de ARNasa murina, 3,75 U de mezcla WarmStart® RTx. Incube 5 min a 25 °C para la hibridación y 10 min a 55 °C para la síntesis. Inactive la RTx con 10 min a 80 °C. P: ¿WarmStart® RTx tiene actividad de ARNasa H? R: Sí, WarmStart® RTx contiene un dominio de ARNasa H activo. P: ¿Qué dNTP recomiendan para usar con WarmStart® RTx? R: Ofrecemos dNTP en dos formatos. Se pueden pedir como una mezcla práctica (Mezcla de solución de desoxinucleótidos, NEB n.° N0447), con una concentración de 10 mM de cada nucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (Juego de solución de desoxinucleótidos, NEB n.° N0446), con una concentración de 100 mM de cada nucleótido). P: ¿Se puede usar ADN como plantilla para WarmStart® RTx? R: Sí, pero la reacción es mucho menos eficiente en comparación con la síntesis de ADN dirigida por ARN. La síntesis de ADN dirigida por ADN representa aproximadamente entre el 10 % y el 20 % de la actividad de la síntesis dirigida por ARN a 45 °C y aproximadamente el 50 % a 55 °C. P: ¿Dispone NEB de una mezcla maestra para reacciones LAMP o RT-LAMP? R: Sí. Ofrecemos varias opciones compatibles con los protocolos LAMP/RT-LAMP. El kit WarmStart® LAMP (ADN y ARN) (NEB n.° E1700) incluye un colorante fluorescente LAMP 50X para la detección fluorescente de reacciones LAMP/RT-LAMP. La mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X (ADN y ARN) (NEB n.° M1800) incluye un indicador colorimétrico basado en pH para la detección visual de reacciones LAMP/RT-LAMP (un cambio de color de rosa a amarillo indica amplificación). Las versiones actualizadas de ambos productos incluyen UDG termolábil y dUTP para reducir el riesgo de contaminación por arrastre (NEB n.° E1708 y NEB n.° M1804, respectivamente). Además, la mezcla maestra multiusos WarmStart LAMP/RT-LAMP 2X (con UDG) (NEB n.° M1708) es compatible con diferentes tipos de entrada de muestra y admite múltiples métodos de detección, incluido el azul de hidroxinaftol. Todas las mezclas maestras LAMP incluyen una combinación de transcriptasa inversa WarmStart RTx y ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart para una amplificación rápida y robusta de dianas de ADN y ARN. Cada mezcla requiere únicamente cebadores LAMP proporcionados por el usuario y muestras de ADN o ARN diana.