New England Biolabs, M0386T, Nucleasa Cas9, S. pyogenes

Ya disponible: EnGen Spy Cas9 HF1 Categorías relacionadas Validación de la edición genética basada en CRISPR, Especificación de nucleasas CRISPR/Cas Materiales necesarios pero no suministrados sgRNA suministrado por el usuario EnGen® sgRNA Synthesis Kit, S. Pyogenes (NEB #E3322) HiScribe® Quick T7 High Yield RNA Synthesis Kit (NEB #E2050) Proveedor externo Agua sin nucleasas (NEB #B1500) Proteinasa K, grado de biología molecular (NEB #P8107). Condiciones de reacción 1X NEBuffer™ r3.1 Incubar a 37 °C 1X NEBuffer™ r3.1 100 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 100 µg/ml Albúmina recombinante (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 5 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Por qué observo una digestión incompleta? R: La digestión incompleta puede deberse a los siguientes factores: Relación incorrecta de la nucleasa Cas9 con el ARN guía y el sitio diana: para una digestión completa, recomendamos una relación molar de 10:10:1 o superior de nucleasa Cas9: ARN guía: sitio diana. Secuencia subóptima del ARN guía: verifique la secuencia y el diseño del ARN guía. ARN guía de mala calidad: verifique la integridad del ARN guía mediante electroforesis en gel. Tampón subóptimo: utilice el NEBuffer 3.1 incluido con la enzima. P: ¿Por qué difiere la eficiencia de la digestión entre dos ARNsg? R: La eficiencia de la digestión puede verse afectada por el diseño del ARNsg. Verifique la secuencia y el diseño de la plantilla de transcripción del ARNsg. La eficiencia de la digestión puede verse afectada por la calidad del ARNsg. Verifique la integridad del ARNsg mediante electroforesis en gel. P: ¿NEB proporciona plásmidos para la clonación de ARNsg? R: No distribuimos plásmidos para la clonación de ARNsg, pero le recomendamos que visite Addgene si desea obtener plásmidos de ARNsg. Las plantillas de ADN de oligonucleótidos que contienen un promotor T7 y codifican ARNsg se pueden utilizar con el kit de síntesis de ARN de alto rendimiento HiScribe T7 (NEB n.° E2050). Recomendamos el kit de síntesis de ARNsg EnGen® para S. pyogenes (NEB n.° E3322S), que utiliza oligonucleótidos de ADN específicos para la diana diseñados por el usuario y proporciona un método rápido para transcribir altos rendimientos de ARNsg en una sola reacción de 30 minutos. P: ¿Contiene la nucleasa Cas9 una señal de localización nuclear (NLS)? R: No, la nucleasa Cas 9 (NEB n.° M0386) no tiene señal de localización nuclear. Ofrecemos un producto alternativo, EnGen® Cas9 NLS para S. pyogenes (NEB n.° M0646), con señal de localización nuclear. P: ¿Está la nucleasa Cas9 fusionada con una etiqueta 6XHis N-terminal? R: Sí. P: ¿Cómo diluyo la enzima a 1 μM para reacciones in vitro? R: Si se planea usar la enzima de mayor concentración para la digestión in vitro de ADN, se puede diluir a 1 μM en 1X NEBuffer™ r3.1 y usar inmediatamente. La dilución de 1 μM en 1X NEBuffer r3.1 no debe congelarse. Si la dilución de 1 μM se va a almacenar a -20 °C, se debe diluir con el Diluyente B (con albúmina recombinante) (NEB n.° B8533S): 300 μM de NaCl, 10 μM de Tris-HCl, 0,1 μM de EDTA, 1 μM de DTT, 500 μg/ml de albúmina recombinante y 50 % de glicerol (pH 7,4 a 25 °C) antes del montaje de la reacción. P: ¿Podrían darme más información sobre el cambio de BSA a albúmina recombinante (albúmina recombinante) en los NEBuffers? A: NEB se complace en anunciar que hemos cambiado los tampones de reacción con BSA (NEBuffer 1.1, 2.1, 3.1 y CutSmart® Buffer) por tampones con albúmina recombinante (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 y rCutSmart™ Buffer). También estamos en proceso de adaptar todas las formulaciones de enzimas de restricción para que contengan albúmina recombinante. Creemos que dejar de usar productos con ingredientes de origen animal es un paso en la dirección correcta y podemos ofrecer esta mejora al mismo precio.