New England Biolabs, M0392L, β-Agarasa I

Categorías relacionadas Otros,, Aplicaciones de extracción de gel de ADN Purificación de ácidos nucleicos Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para digerir 200 μl de agarosa fundida de bajo punto de fusión o NuSieve a neoagaro-oligosacáridos no precipitables en 1 hora a 42 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción de β-agarasa I 1X Incubar a 42 °C Tampón de reacción de β-agarasa I 1X Bis-Tris-HCl 10 mM EDTA 1 mM (pH 6,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Bis-Tris-HCl 50 mM EDTA 1 mM Glicerol al 50 % pH 6,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 15 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Se pueden realizar la ligadura y otras manipulaciones de ADN en cortes de gel tratados con β-agarasa I que contienen ADN? R: Sí. P: ¿Cuál es el peso molecular de la β-Agarasa I? R: 30.000 Daltons P: ¿Qué tipo de agarosa digiere la β-Agarasa I? R: Solo la agarosa de bajo punto de fusión es adecuada para la digestión con β-Agarasa I, ya que la solución debe ser líquida a la temperatura de incubación de 42 °C. Si la temperatura cae por debajo de 42 °C durante el tiempo de reacción, incluso la agarosa de bajo punto de fusión comenzará a solidificarse y será indigerible. P: ¿Funcionará la β-Agarasa I en otros tampones? R: Sí. La β-Agarasa I funcionará en agua y otros tampones. La concentración de β-Agarasa I debe duplicarse para una actividad completa en otros tampones. El EDTA en el tampón de β-Agarasa I protege al ADN de un bajo nivel de mellas que se observa en tampones que contienen magnesio. P: ¿Por qué se forma un precipitado blanco después de la reacción con β-Agarasa I? R: La reacción no se completó. Vea las preguntas a continuación para optimizar la reacción. P: ¿Se puede digerir un gel de alto porcentaje y bajo punto de fusión con β-agarasa I? R: La β-agarasa I funciona más eficientemente en soluciones que contienen 1% de agarosa o menos. Para una digestión máxima de geles con mayor porcentaje, derrita el corte de gel a 65 °C y ajuste el volumen con tampón 1X de β-agarasa I para que la concentración final de agarosa sea del 1%. P: ¿Cuál es una causa común del fracaso de la reacción de la β-agarasa I? R: Trabajar a la temperatura incorrecta. La β-agarasa I se inactiva rápidamente a temperaturas superiores a 45 °C. La agarosa de bajo punto de fusión debe fundirse a 65 °C y luego equilibrarse a 42 °C. Por lo tanto, cuando trabaje con grandes volúmenes, asegúrese de dejar suficiente tiempo para que el agar fundido se equilibre a 42 °C. A temperaturas más bajas, la agarosa comienza a solidificarse, lo que la hace resistente a la digestión. P: ¿El tampón de corrida del gel afecta la reacción de la β-agarasa I? R: La β-agarasa I funciona mejor en geles elaborados con tampón Tris-acetato (TAE). Para geles elaborados con tampón Tris-borato (TBE), se recomienda duplicar la cantidad necesaria de β-agarasa I. P: ¿Cómo se puede inactivar la β-agarasa I por calor? R: La incubación a 95 °C durante 2 minutos o a 65 °C durante 15 minutos inactiva 50 unidades de β-agarasa I. P: ¿Cuál es la estabilidad de la β-agarasa I en la reacción? R: La β-agarasa I conserva su actividad durante varias horas a 45-50 °C y se estabiliza con la presencia de agarosa en la reacción. P: ¿Cuál es el pH óptimo para la digestión con β-agarasa I? R: La β-agarasa I presenta una actividad óptima a un pH de 6,5. Más del 75% de la actividad óptima se mantiene entre pH 5,0 – 8,5.