New England Biolabs, M0402L, ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (sin glicerol)

Categorías relacionadas Amplificación isotérmica y desplazamiento de cadena Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle, Amplificación isotérmica, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 25 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 65 °C. Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 0,1 % Triton® X-100 pH 7,1 a 25 °C Inactivación por calor 80 °C durante 20 minutos Condiciones del ensayo unitario 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10 mM MgCl 2 , 30 nM M13mp18 SS DNA, 70 nM M13 cebador de secuenciación (–47) 24 mer, 200 μM dATP, 200 μM dCTP, 200 μM dGTP, 100 μM dTTP incluyendo [ 3 H]-dTTP y 100 μg/ml de rAlbúmina. Preguntas frecuentes P: ¿Las ADN polimerasas NEB se suministran con los dNTP? R: No, los dNTP deben pedirse por separado. Se pueden pedir como una mezcla práctica (Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.º N0447) con una concentración de 10 mM de cada desoxinucleótido) o como un conjunto de 4 tubos individuales (Juego de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.º N0446) con una concentración de 100 mM de cada desoxinucleótido). P: ¿Se puede inactivar la ADN polimerasa Bst 2.0® por calor? R: Sí, calentar a 80 °C durante 20 minutos. P: ¿Se puede utilizar la ADN polimerasa Bst 2.0® en aplicaciones que requieren ciclado térmico? R: No, las temperaturas de reacción son demasiado altas para la estabilidad de la enzima. P: ¿Puede la ADN polimerasa Bst 2.0® iniciarse en una muesca del ADN? R: Sí, puede iniciar la síntesis de la cadena en una muesca utilizando el 3' OH como cebador. P: ¿Se puede usar la ADN polimerasa Bst 2.0® a temperaturas distintas de 65 °C? R: Sí, la enzima tiene las siguientes actividades: 10-15 % a 37 °C 30-50 % a 50 °C 100 % a 60-70 °C 30-50 % a 72 °C. No se recomienda usar Bst 2.0 a temperaturas superiores a 72 °C, ya que se inactiva con el calor. P: ¿Se puede diluir la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (sin glicerol) a 120 000 U/ml antes de usarla? R: Sí, la enzima de 120 000 U/ml se puede diluir en tampón de amplificación isotérmica 1X (liocompatible) a 8000 U/ml antes de usarla. La dilución de 8000 U/ml es estable a 4 °C durante al menos 7 días. P: ¿Incorpora dUTP la ADN polimerasa Bst 2.0®? R: Sí. La ADN polimerasa Bst 2.0® puede utilizarse con una mezcla de dUTP y dTTP o con la sustitución completa de dTTP por dUTP. El uso de dUTP al 100 % puede inhibir parcialmente las reacciones de Bst 2.0 (hasta el doble del tiempo umbral de amplificación), pero se mantiene un rendimiento estable. Referencia: Kuangwen Hsieh, Peter L. Mage, Andrew T. Csordas, Michael Eisenstein, H. Tom Soh. (2014). Eliminación simultánea de la contaminación por arrastre y detección de ADN con amplificación isotérmica mediada por bucle suplementada con uracil-ADN-glicosilasa (UDG-LAMP). Royal Society of Chemistry. PubdMedID: 24577617. P: ¿Incluye B1714: Tampón de Amplificación Isotérmica 10X (Liocompatible) algún excipiente? R: No, el tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) no incluye excipientes para liofilización. El usuario final debe seleccionar los excipientes en la aplicación de interés. @font-face {font-family:"Cambria Math"; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat: sí; padre-estilo-mso:""; margen: 0 pulgadas; mso-paginación:viuda-huérfana; tamaño de fuente: 12,0 puntos; familia de fuentes: "Times New Roman", serif; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props: sí; familia de fuentes-mso-ascii:Calibri; mso-ascii-theme-font:minor-latin; familia de fuentes mso-fareast:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligatures:none;}div.WordSection1 {page:WordSection1; P: ¿Cómo se utiliza el UDG Termolábil Antártico para la prevención de contaminación por arrastre en reacciones LAMP? R: La prevención de contaminación por arrastre requiere dos pasos: la incorporación de dUTP por una ADN polimerasa durante la generación del amplicón, la escisión de dichos uracilos en los productos amplificados y la destrucción del amplicón catalizada por un UDG. Para LAMP, las reacciones deben ejecutarse con una inclusión de ~50% de dUTP mezclado con dTTP (p. ej., 1,4 mM de dATP, dCTP, dGTP, 0,7 mM de dTTP y dUTP) y debe utilizarse una ADN polimerasa Bst para una incorporación eficiente de dU sin inhibición significativa de la reacción. Para la posterior destrucción de productos contaminantes, se recomienda encarecidamente el UDG termolábil antártico en lugar del UDG de E. coli, más termoestable. Incluya 0,5 μL de UDG termolábil antártico por cada 25 μL de reacción LAMP y simplemente configure y ejecute sus reacciones LAMP de forma normal. La actividad del UDG durante la configuración y el calentamiento a 65 °C destruirá rápida y eficientemente cualquier producto contaminante. Si se requiere una descontaminación más rigurosa, se pueden añadir 10 minutos a 25 °C al inicio del flujo de trabajo. Para simplificar, se han incluido dUTP y UDG en una mezcla maestra colorimétrica WarmStart LAMP 2X actualizada con UDG y kit LAMP fluorescente WarmStart LAMP/RT-LAMP fluorescente (con UDG). P: ¿Cuántos ciclos de congelación/descongelación puede tolerar la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (sin glicerol)? R: La ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® (sin glicerol) se analizó hasta 30 ciclos de congelación/descongelación a 8000 U/mL y no mostró pérdida de actividad en una reacción LAMP. Sin embargo, se debe evitar la congelación y descongelación repetidas de este producto. La enzima (120 000 U/ml) puede almacenarse a 4 °C hasta un mes. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debo usarlas? A: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La distinción entre Hot Start y WarmStart es que las enzimas Hot Start son termófilas mientras que las enzimas WarmStart® son mesófilas; el rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos diseñados que se unen a una molécula diana específica a través de interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición y/o reducir los efectos secundarios no deseados. El beneficio de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen reversiblemente de manera dependiente de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se denomina "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas y de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Qué son LAMP y RT-LAMP? A: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin necesidad de equipos sofisticados. Utiliza una ADN polimerasa con desplazamiento de soporte, como la ADN polimerasa Bst, y de 4 a 6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas del ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) y resultados rápidos: las reacciones pueden realizarse en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones pueden realizarse con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB n.° M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN, acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de aplicaciones LAMP. P: ¿Cuál es la diferencia entre la ADN polimerasa Bst, fragmento grande, Bst 2.0, Bst 3.0 y la ADN polimerasa Bst-XT? R: Las cuatro polimerasas son ADN polimerasas moderadamente termoestables con actividad de desplazamiento de cadena, lo que les permite realizar reacciones de amplificación isotérmica como LAMP. La ADN polimerasa Bst 2.0 es un homólogo de la ADN polimerasa Bst, fragmento grande, diseñado in silico. Está diseñada para mejorar las propiedades en las reacciones LAMP, incluyendo la tolerancia a la sal, la termoestabilidad y la incorporación de dUTP. La Bst 2.0 destaca por su alta especificidad. Bst 3.0 ofrece algunas mejoras con respecto a Bst 2.0, destacando su mayor velocidad de amplificación. Bst 3.0 también ha mejorado su rendimiento en reacciones LAMP a temperaturas más altas (hasta 72 °C); sin embargo, para algunos objetivos, Bst 3.0 no conserva la alta especificidad de Bst 2.0. Bst-XT combina las propiedades más deseables de Bst 2.0 y Bst 3.0. Ofrece la alta especificidad de Bst 2.0 y la rápida velocidad de amplificación de Bst 3.0. Bst-XT también es activo en un rango de temperatura más amplio, lo que permite reacciones LAMP entre 50 y 70 °C. Bst-XT WarmStart NEB #M9204 Bst 2.0 WarmStart NEB #M0538 Bst 3.0 NEB #M0374 Velocidad de amplificación ★★★★★ ★★★★★ Especificidad ★★★★★ ★★★★★ ★★ ¿Configuración a temperatura ambiente? Habilitado Habilitado No recomendado Temperatura óptima de LAMP 50-70 °C 60-70 °C 55-72 °C Disponible sin glicerol Sí NEB #M9205 Sí NEB #M0402 Sí NEB #M0443 ★★★★★ = producto óptimo recomendado para la aplicación seleccionada ★★ o ★★★ = realizará la aplicación seleccionada ★ = puede realizar pero no se recomienda P: ¿Cuál es la diferencia entre los tampones B1714: tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) y B0537: tampón de amplificación isotérmica 10X? R: La enzima sin glicerol estará activa en ambos tampones de amplificación isotérmica, pero el tampón liocompatible (NEB n.º B1714) está optimizado para su uso en flujos de trabajo de liofilización. P: ¿Cuál es la concentración de Mg2+ en el tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible)? R: El tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) contiene 80 mM de MgSO4 y, por lo tanto, 8 mM de MgSO4 en la reacción final 1X. P: ¿Cuándo debería elegirse la enzima Bst 2.0® ADN polimerasa? R: La Bst 2.0 ADN polimerasa muestra una alta actividad de desplazamiento de cadena. Cubre un vacío entre las polimerasas termófilas y mesófilas. La temperatura óptima de 60-70 °C es superior a la de la ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) (NEB# M0210) e inferior a la de la ADN polimerasa Vent (NEB# M0254), otras dos polimerasas de desplazamiento de cadena. Esto ofrece a los investigadores un rango más amplio de condiciones de reacción para optimizar el desplazamiento de cadena y la hibridación de cebadores. Esto resulta útil en el diseño de estrategias de secuenciación, así como en tecnologías de amplificación isotérmica. La elevada temperatura de reacción facilita la secuenciación a través de regiones ricas en GC. P: ¿Por qué debería usar la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart®? R: La ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® ofrece todas las propiedades mejoradas de la ADN polimerasa Bst 2.0, con la ventaja adicional de poder preparar la reacción a temperatura ambiente. Las ADN polimerasas presentan una actividad no deseada, no moldeada, a temperaturas inferiores a las establecidas para la amplificación, lo que puede afectar significativamente el rendimiento y la reproducibilidad. El aptámero de la ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart® inhibe la actividad de la ADN polimerasa por debajo de 45 °C, por lo que las reacciones pueden prepararse a temperatura ambiente.