New England Biolabs, M0437M, T4 ARN ligasa 1 (ssRNA ligasa), alta concentración

También hay disponible una versión de concentración regular (10 000 unidades/ml) de esta enzima, la ligasa de ARN T4 1 (ligasa de ARNss) ( Categorías relacionadas Aplicaciones de ligadura de ARN Clonación de ARN Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Inhibidor de ARNasa, murino (NEB n.º M0314) (opcional) Agua sin nucleasas (NEB n.º B1500) DMSO al 100 % Definición de la unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 nanomol de 5'- [32 P rA 16 en una forma resistente a la fosfatasa en 30 minutos a 37 °C Condiciones de reacción Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X Suplemento con 1 mM de ATP Incubar a 25 °C Tampón de reacción de la ligasa de ARN T4 1X Tris-HCl 50 mM MgCl2 10 mM DTT 1 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento KCl 50 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,5 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 15 minutos Condiciones del ensayo unitario Se mezcla tampón de reacción de la ARN ligasa T4 1X, suplementado con ATP 1 mM, con el sustrato de ARN (10 μM de 5'-[32P]rA16) y cantidades variables de enzima. La incubación se realiza a 37 °C durante 15 minutos (8). Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la temperatura y el tiempo de reacción óptimos para la ARN ligasa T4 I? R: En general, un mayor tiempo de reacción y una menor temperatura de reacción producen reacciones de ligación más completas. Una reacción de ligación típica debe llevarse a cabo a 25 °C durante un máximo de 2 horas. Para oligonucleótidos más largos, 2 horas de incubación a 25 °C seguidas de una noche La incubación a 16 °C puede mejorar el rendimiento. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa T4 1 para marcar los extremos de ADN o ARN monocatenario? R: La ARN ligasa T4 1 se puede usar para marcar el extremo 3' del ARN monocatenario. La transferasa terminal (#M0315) se puede usar para marcar el extremo 3' del ADN monocatenario. La T4 PNK (#M0201) se puede usar para marcar el extremo 5' del ADN monocatenario. P: ¿La ARN ligasa T4 1 liga el ADN bicatenario? R: No, no significativamente. Contrariamente a los informes iniciales, la ARN ligasa T4 1 no mejora significativamente la ligadura de extremos romos cuando se usa con la ARN ligasa T4 1. (1). (1) Sugino, A. et al. (1977) J. Biol. Chem. 252, 3987-3994. P: ¿Cuál es la causa más común de fallo de ligadura al usar la ARN ligasa T4? 1? R: La estructura secundaria del ARN que protege los extremos puede inhibir la ligadura. La adición de DMSO al 10 % (v/v) puede aumentar la ligadura en estos casos. P: ¿Por qué el nuevo tampón de reacción de la ARN ligasa T4 no contiene ATP? R: Para ofrecer a los clientes mayor flexibilidad en el uso de este producto, ahora ofrecemos soluciones de 10 mM de ATP y 50 % de PEG8000 como componentes separados del tampón enzimático. El tampón de reacción de la ARN ligasa T4 (NEB n.° B0216) también es compatible con la ARN ligasa T4 2 truncada (NEB n.° M0242) y la ARN ligasa T4 2 truncada K227Q (NEB n.° M0351). P: ¿La ARN ligasa T4 1 liga el ADN monocatenario? R: Sí. La reacción es más lenta que la de ARN/ARN o ARN/ADN. Por ejemplo, los cebadores pueden ligarse al ADNc (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, págs. 9823-9825. P: ¿La reacción de ligadura con la ARN ligasa 1 de T4 producirá círculos o productos dúplex? R: La reacción puede producir ambos. La unidad se define por la producción de círculos utilizando rA-20mer como sustrato. Aumentar la concentración y la longitud, y añadir PEG, puede aumentar el número de ligaduras intermoleculares. Bloquear un extremo de la molécula con un terminador didesoxi, evitará que la molécula forme un círculo. P: ¿Se puede utilizar la ARN ligasa 1 de T4 para crear híbridos de ARN/ADN monocatenarios? R: Sí. P: ¿Puede la ARN ligasa 1 de T4 ligar trifosfatos? R: No. Sin embargo, el ARN puede tratarse primero con CIP para eliminar el trifosfato y, a continuación, con una quinasa para añadir un solo fosfato. Los fragmentos que contienen estos monofosfatos 5' pueden ligarse mediante la ARN ligasa de T4. 1. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para añadir colas al ADN dúplex lineal? R: Sí, los oligos de ARN se pueden ligar a ADN dúplex con extremos romos o cohesivos. Los oligos de ADN se ligan a una velocidad considerablemente menor (3). (3) Higgins, NP et al. (1979) NAR 6, págs. 1013-1024. P: ¿Se puede usar un didesoxi para bloquear la ligación con la ARN ligasa 1 de T4? R: Sí (2). (2) Troutt, AB, et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, págs. 9823-9825. P: ¿Se puede usar la ARN ligasa 1 de T4 para incorporar aminoácidos artificiales a las proteínas? R: Sí, véase la referencia Noren, CJ et al. (1989) Science 244, 182-188. P: ¿Mejorará el PEG la ligación con ¿T4 ARN ligasa 1? R: Sí (4). El tampón del kit de ligadura rápida (NEB n.° M2200) se puede usar con la T4 ARN ligasa 1. (4) Harrison, B. y Zimmerman, SB, (1984) NAR 12, 8235-8251. P: ¿Se puede comprar PEG 8000? R: El PEG 8000 se incluye como componente del tampón de reacción de la T4 ARN ligasa (NEB n.° B0216).