New England Biolabs, M0439L, WarmStart® RTx Transcriptasa inversa (sin glicerol)

Categorías relacionadas Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, Amplificación isotérmica y desplazamiento de cadena, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones Amplificación isotérmica mediada por bucle, Amplificación de ADN, PCR y qPCR Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Mezcla de solución de desoxinucleótido (dNTP) (NEB n.º N0447) Agua libre de nucleasas (NEB n.º B1500) Inhibidor de ARNasa, murino (NEB n.º M0314) Preguntas frecuentes P: ¿Qué es LAMP y RT-LAMP? R: La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es un método de amplificación isotérmica diseñado para detectar un ácido nucleico diana sin requerir equipo sofisticado. Utiliza una ADN polimerasa de desplazamiento de soporte como una ADN polimerasa Bst y 4-6 cebadores que reconocen de 6 a 8 regiones distintas de ADN diana para una reacción de amplificación altamente específica. LAMP ofrece alta sensibilidad (hasta fg o <10 copias de la diana) con resultados rápidos: las reacciones se pueden realizar en tan solo 5-10 minutos. Las reacciones se pueden realizar con recursos limitados, utilizando un baño de agua para la incubación y la detección visual de los resultados, o con medición en tiempo real e instrumentos de alto rendimiento. La detección de dianas de ARN se logra simplemente añadiendo una transcriptasa inversa a la reacción LAMP, con RT-LAMP como un flujo de trabajo isotérmico de un solo paso. La transcriptasa inversa WarmStart RTx (NEB #M0380) es una ADN polimerasa dirigida por ARN acoplada a un aptámero de unión reversible que inhibe la actividad de RTx por debajo de 40 °C, lo que la hace especialmente adecuada para RT-LAMP. Para obtener más información y ver nuestra oferta de productos LAMP, visite la página de descripción general de la aplicación LAMP. P: ¿Qué ventajas ofrece WarmStart® RTx? R: Similar al uso de las ADN polimerasas de inicio en caliente, una transcriptasa inversa de inicio en caliente permite un rendimiento constante en las reacciones de amplificación. Con la propiedad WarmStart®, cualquier reacción RT-LAMP con WarmStart RTx o ADN polimerasa Bst 2.0 WarmStart (NEB n.° M0538) puede configurarse a temperatura ambiente, sin amplificación inespecífica. Este control proporciona un mayor grado de especificidad a las reacciones de detección y amplificación de ARN, y permite flexibilidad en configuraciones de alto rendimiento o sin hielo. P: ¿Qué tan sensible es la amplificación de ARN con WarmStart® RTx? R: Las reacciones RT-LAMP de un solo paso con WarmStart RTx pueden proporcionar de forma rutinaria la amplificación de la diana con tan solo 1 pg de ARN de entrada. Las reacciones RT-PCR con WarmStart RTx o Hot Start Taq pueden proporcionar la amplificación de la diana con tan solo 10 fg de ARN de entrada. P: ¿Se puede inactivar WarmStart® RTx? R: Recomendamos calentar a 80 °C durante 10 minutos. P: ¿WarmStart® RTx es activo en otros tampones? R: Sí, WarmStart® RTx generalmente es activo en tampones con pH >7,5, 10–200 mM de sal monovalente y 2–20 mM de Mg₂. Actividad en otros tampones NEB: NEBuffer1.1: 10 % NEBuffer2.1: 75 % NEBuffer3.1: 75 % CutSmart™ Buffer: 90 % ThermoPol™: 90 % P: ¿Cuál es la longitud máxima del producto de ADNc producido por WarmStart® RTx? R: WarmStart RTx se desarrolló para obtener el mejor rendimiento con amplicones cortos en reacciones de amplificación diagnóstica (p. ej., RT-LAMP y RT-PCR). Sin embargo, funciona bien en la síntesis de ADNc, con productos de hasta 5 kb. Para productos más largos, recomendamos ProtoScript® II (NEB n.º M0368) o el práctico kit de síntesis de ADNc de primera hebra ProtoScript II (NEB n.º E6560). Para los productos de ADNc más largos, recomendaríamos Induro® Reverse Transcriptase (NEB #M0681), una RT codificada por intrones del grupo II. P: ¿WarmStart® RTx tiene actividad de ARNasa H? R: Sí, WarmStart® RTx contiene un dominio de ARNasa H activo. P: ¿Se puede usar ADN como plantilla para WarmStart® RTx? R: Sí, pero la reacción es mucho menos eficiente en comparación con la síntesis de ADN dirigida por ARN. La síntesis de ADN dirigida por ADN es ~10-20% de la actividad de la dirigida por ARN a 45 °C y ~50% a 55 °C. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas; el rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiente de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ssADN de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación fuera del objetivo y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más estricta. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraron en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas y de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cuál es la diferencia entre los tampones B1714: tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) y B0537: tampón de amplificación isotérmica 10X? R: La enzima sin glicerol estará activa en ambos tampones de amplificación isotérmica, pero el tampón liocompatible (NEB n.° B1714) está optimizado para su uso en procesos de liofilización. P: ¿Cuál es la concentración de Mg₂₄ en el tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible)? R: El tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) contiene 80 mM de MgSO₄ y, por lo tanto, 8 mM de MgSO₄ en la reacción final 1X. P: ¿El tampón de amplificación isotérmica B1714: 10X (liocompatible) incluye excipientes? R: No, el tampón de amplificación isotérmica 10X (liocompatible) no incluye excipientes para liofilización. El usuario final debe seleccionar los excipientes en la aplicación de interés. @font-face {font-family:"Cambria Math"; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat: sí; padre-estilo-mso:""; margen: 0 pulgadas; mso-paginación:viuda-huérfana; tamaño de fuente: 12,0 pt; familia de fuentes: "Times New Roman", serif; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props: sí; familia de fuentes-mso-ascii:Calibri; fuente-tema-mso-ascii: menor-latín; familia de fuentes mso-fareast:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligatures:none;}div.WordSection1 {page:WordSection1; P: ¿Se puede diluir la transcriptasa inversa WarmStart® RTx (sin glicerol) a 75 000 U/ml antes de su uso? R: Sí, la enzima de 75 000 U/ml se puede diluir en tampón de amplificación isotérmica 1X (liocompatible) a 15 000 U/ml antes de su uso. La dilución de 15 000 U/ml es estable a 4 °C durante al menos 7 días. @font-face {familia de fuentes:"Cambria Math"; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; conjunto de caracteres de fuente mso:0; familia de fuentes genéricas mso:roman; paso de fuente mso:variable; firma de fuente mso:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {familia de fuentes:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; conjunto de caracteres de fuente mso:0; familia de fuentes genéricas mso:swiss; paso de fuente mso:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat: sí; padre-estilo-mso:""; margen: 0 pulgadas; mso-paginación:viuda-huérfana; tamaño de fuente: 12,0 pt; familia de fuentes: "Times New Roman", serif; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props: sí; familia de fuentes-mso-ascii:Calibri; fuente-tema-mso-ascii: menor-latín; familia de fuentes mso-fareast:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; mso-hansi-font-family:Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligatures:none;}div.WordSection1 {page:WordSection1;} P: ¿Cuántos ciclos de congelación/descongelación puede tolerar la transcriptasa inversa WarmStart® RTx (sin glicerol)? R: La transcriptasa inversa WarmStart® RTx (sin glicerol) se probó hasta 10 ciclos de congelación/descongelación a 75 000 U/ml y no mostró pérdida de actividad en una reacción RT-LAMP. Sin embargo, se debe evitar la congelación y descongelación repetidas de este producto. La enzima (75 000 U/ml) puede almacenarse a 4 °C hasta por un mes. @font-face {font-family:"Cambria Math"; panose-1:2 4 5 3 5 4 6 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:roman; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-536870145 1107305727 0 0 415 0;}@font-face {font-family:Calibri; panose-1:2 15 5 2 2 2 4 3 2 4; mso-font-charset:0; mso-generic-font-family:swiss; mso-font-pitch:variable; mso-font-signature:-469750017 -1040178053 9 0 511 0;}p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-unhide:no; mso-style-qformat: sí; padre-estilo-mso:""; margen: 0 pulgadas; mso-paginación:viuda-huérfana; tamaño de fuente: 12,0 pt; familia de fuentes: "Times New Roman", serif; mso-fareast-font-family:"Times New Roman";}.MsoChpDefault {mso-style-type:export-only; mso-default-props: sí; familia de fuentes-mso-ascii:Calibri; fuente-tema-mso-ascii: menor-latín; familia de fuentes mso-fareast:Calibri; mso-fareast-theme-font:minor-latin; familia de fuentes mso-hansi: Calibri; mso-hansi-theme-font:minor-latin; mso-bidi-font-family:"Times New Roman"; mso-bidi-theme-font:minor-bidi; mso-font-kerning:0pt; mso-ligaduras: ninguna;}div.WordSection1 {página:WordSection1;}