New England Biolabs, M0458S, Ligasa RtcB

Categorías relacionadas Aplicaciones de ligadura de ARN Clonación de ARN Especificación Condiciones de reacción Suplemento de tampón de reacción RtcB 1X con GTP 0,1 mM y MnCl2 1 mM Incubar a 37 °C Tampón de reacción RtcB 1X Tris-HCl 50 mM KCl 75 mM MgCl2 3 mM DTT 10 mM (pH 8,3 a 25 °C) Tampón de almacenamiento NaCl 50 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Afecta la estructura secundaria a la ligadura por la ligasa RtcB? R: Sí. La ligasa RtcB requiere que el extremo 3' del ARN donante sea monocatenario para ligarse de manera eficiente. Los sustratos bicatenarios o un oligonucleótido de ferulización bloquearán la ligadura. P: ¿Puede la ligasa RtcB ligar ADN? R: Sí. Estudios publicados y pruebas internas han demostrado que la ligasa RtcB es capaz de ligar donantes de ADN a aceptores de ADN o donantes de ARN a aceptores de ADN, aunque con una eficiencia reducida. Las mismas restricciones estructurales se aplican a los sustratos de ADN que a los sustratos de ARN. P: ¿Cuál es la temperatura de reacción óptima para la ligasa RtcB? R: La temperatura de reacción óptima para la ligasa RtcB es de 37 °C. P: ¿Se puede usar la ligasa RtcB en otros NEBuffers? R: Si bien la ligasa RtcB tiene una actividad óptima en el tampón suministrado, también es activa en NEBuffer 3 y 1 con una actividad del 30 % y el 10 %, respectivamente. El uso de estos tampones requiere la adición de 0,1 mM de GTP y 1 mM de MnCl2. P: ¿Cómo puedo aumentar la eficiencia de la ligación? R: Extender el tiempo de ligación o agregar más enzima aumentará la eficiencia de la ligación. P: ¿Se puede sustituir el manganeso por magnesio u otro catión divalente? R: No. La actividad de la ligasa RtcB requiere específicamente manganeso y no es reemplazable por ningún otro catión divalente. P: ¿Mejora el PEG la eficiencia de la ligación? R: En las condiciones recomendadas, el PEG8000 no ofrece ningún beneficio cuando se utilizan cantidades equimolares de ligasa y sustrato. Cuando la cantidad de sustrato excede la enzima, la adición de un 15 % de PEG8000 proporciona la máxima mejora en la eficiencia de la ligación. P: ¿Puedo comprar grandes cantidades de una enzima para innovación existente? R: Sí, si necesita grandes cantidades de una enzima para innovación, póngase en contacto con NEB en EnzymesForInnovation@neb.com. Tenga en cuenta que la disponibilidad puede ser limitada y, por lo tanto, se requieren plazos de entrega más largos para pedidos grandes. También podrían ser necesarias pruebas de control de calidad adicionales para satisfacer su aplicación y necesidades específicas. P: ¿Qué son las enzimas para innovación? R: Enzimas para la Innovación (EFI) es un proyecto iniciado por NEB para proporcionar enzimas únicas a la comunidad científica con la esperanza de facilitar el descubrimiento de aplicaciones nuevas e innovadoras. Estas enzimas poseen propiedades interesantes y especificidades únicas que no están disponibles comercialmente en otros lugares con la calidad que se espera de NEB. Los graduados de Enzimas para la Innovación son enzimas que han pasado de tener aplicaciones desconocidas o exploratorias a convertirse en la piedra angular de una aplicación definida. Si tiene una idea para una "Enzima para la Innovación" con una aplicación sugerida que pueda ser útil, envíenos un correo electrónico a EnzymesForInnovation@neb.com. Para más información, vea el video.