New England Biolabs, M0460T, ARN polimerasa T7 (alta concentración)

Transcripción usando el promotor del fago T7 Categorías relacionadas Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN Amplificación mediada por transcripción y NASBA Definición de unidad de especificación Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 1 nmol de ATP en material insoluble en ácido en un volumen de reacción total de 50 μl en 1 hora a 37 °C. Condiciones de reacción Tampón de reacción 1X RNAPol Incubar a 37 °C Tampón de reacción 1X 40 mM Tris-HCl 6 mM MgCl2 1 mM DTT 2 mM espermidina (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 50 mM Tris-HCl 100 mM NaCl 20 mM β-ME 1 mM EDTA 50 % Glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 7,9 a 25 °C Condiciones del ensayo unitario Tampón de reacción 1X RNAPol, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y 1 µg de ADN T7 en 50 μl. Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la secuencia promotora de la ARN polimerasa T7? A: Promotor T7 5' TAATACGACTCACTATAG 3' La ARN polimerasa T7 inicia la transcripción en la G subrayada de la secuencia promotora. Luego, la polimerasa transcribe usando la hebra opuesta como molde de 5'->3'. La primera base de la transcripción será una G. P: ¿Es posible iniciar la transcripción con una A? R: La ARN polimerasa T7 puede iniciar la transcripción con una A bajo el promotor T7 de clase II. De forma similar al promotor T7 normal, se prefiere la G en la 2.ª y 3.ª posición. Promotor T7 clase II 5'- TAATACGACTCACTATTA 3' P: ¿Requiere un cebador la reacción de transcripción con la ARN polimerasa T7? R: No, la ARN polimerasa T7 reconoce su secuencia promotora específica e inicia la transcripción en la G final. Luego, la polimerasa transcribe usando la hebra opuesta como molde de 5'->3'. P: ¿La ARN polimerasa T7 deja una base extra al final de una transcripción? R: Sí, la ARN polimerasa T7 puede añadir una o varias bases extra al final de una transcripción, produciendo un conjunto de transcripciones con extremos 3' heterogéneos. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa T7 en sustrato monocatenario? R: No, la región de la secuencia promotora debe ser bicatenaria. P: ¿Funcionará la ARN polimerasa T7 en ADN plasmídico sin cortar? R: Sí, pero la ARN polimerasa T7 es una enzima extremadamente procesiva y continuará transcribiendo alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. El plásmido se puede linealizar con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Se puede producir ARN aberrante al usar la ARN polimerasa T7? R: Se ha observado ARN aberrante cuando la enzima de restricción utilizada para linealizar el plásmido aguas abajo del ADN de interés produce un saliente 3'. Para evitar esto, el plásmido debe cortarse con una enzima de restricción que deje un saliente romo o 5' aguas abajo del ADN de interés. P: ¿Cómo se puede maximizar la producción de ARN al usar la ARN polimerasa T7? R: Se pueden obtener mayores producciones de ARN elevando las concentraciones de NTP (hasta 4 mM cada una). La concentración de Mg2+ debe elevarse a 4 mM por encima de la concentración total de NTP. Además, se puede añadir pirofosfatasa inorgánica a una concentración final de 4 unidades/ml para reducir la inhibición por retroalimentación. P: ¿Puedo usar la ARN polimerasa T7 para crear sondas radiomarcadas de alta actividad específica? R: Sí, se pueden usar la ARN polimerasa T7, la ARN polimerasa SP6, la ARN polimerasa T3 y el kit HiScribe T7 (NEB n.° E2040) para crear sondas de ARN. Se puede obtener una mayor sensibilidad de detección de ácidos nucleicos utilizando una sonda de ARN debido a la mayor estabilidad de los híbridos ARN/ADN que los híbridos ADN/ADN. P: ¿Cuáles son las principales causas del fallo de la reacción utilizando la ARN polimerasa T7? R: La ARN polimerasa T7 es extremadamente sensible a la inhibición de la sal. La concentración de sal monovalente no debe superar los 20 mM. La plantilla de ADN debe prepararse sin sal. La contaminación con ARNasa degradó el producto de ARN. Recomendamos utilizar el inhibidor de ARNasa (NEB n.º 0314 o n.º M0307) en la reacción a 1 unidad/ul. Utilice agua ultrapura y asegúrese de que la plantilla de ADN haya sido extraída con fenol/cloroformo. P: ¿Por qué es baja la actividad específica de la sonda? R: La concentración del nucleótido radiactivo debe ser limitante (6 μM). En otras palabras, si se utiliza ATP marcado, se agregan 500 μM de UTP, CTP y GTP, pero solo 6 μM de ATP en la transcripción para que el ATP se incorpore en un porcentaje mayor, lo que da como resultado una sonda de ARN muy caliente.