Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra, M0463S, yDcpS

yDcpS es una enzima de descapsulado que hidroliza m Categorías relacionadas Modificación de ARN Unidad de especificación Definición Una unidad se define como la cantidad de yDcpS necesaria para convertir el 50 % de una solución de 500 nM del siguiente ARN de 25 meros con capuchón m7G en una forma 5'-difosforilada en un volumen de reacción total de 20 μl en 1 hora a 37 °C: 5'-[m7Gppp]rGrUrArGrArArCrUrUrCrGrUrCrGrArGrUrArCrGrCrUrCrArA[3-6FAM]-3' Condiciones de reacción Tampón de reacción yDcpS 1X Incubar a 37 °C Tampón de reacción yDcpS 10 mM Bis-Tris-HCl 1 mM EDTA (pH 6,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 300 mM NaCl 10 mM Tris-HCl 0,1 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 70 °C Actividad específica 20 000 unidades/mg Condiciones del ensayo Tampón de reacción 1X yDcpS con 500 nM de ARN 3'-FAM de 25 meros con protección m 7 G. Tras la incubación a 37 °C durante 1 hora, yDcpS se inactiva a 70 ˚C durante 15 minutos y la desprotección se mide mediante electroforesis capilar. Preguntas frecuentes P: ¿Es yDcpS una alternativa a la pirofosfotasa ácida del tabaco (TAP)? R: No. yDcpS deja un extremo difosfato 5' tras la desprotección, que no es directamente ligable. TAP deja atrás un monofosfato 5' que puede usarse para la ligadura directa utilizando la ARN ligasa T4. P: En la literatura, se informa que DcpS no tiene actividad en transcripciones de más de 25 nt. ¿Es yDcpS de NEB activo en transcripciones más largas? R: Sí. La actividad de decapitación de yDcpS se ha verificado en transcripciones in vitro de hasta 1,4 kb, así como en el ARN humano total. P: ¿Es yDcpS activo en el tampón de capuchón suministrado con el sistema de capuchón Vaccinia (NEB n.º M2080)? R: No. La actividad de yDcpS es sensible al KCl y al pH ≥7,5, ambos presentes en el tampón de capuchón. P: ¿Cuál es la especificidad del objetivo de yDcpS? R: yDcpS tiene actividad de decapitación en la mayoría de las capuchones basados ​​en guanosina, pero no tiene actividad en los capuchones A, C o U. Las estructuras Cap0 y Cap1 son descapsuladas por yDcpS. Es importante destacar que yDcpS no elimina las tapas de destiobiotina GTP ni m2,2,7G. P: ¿Es la actividad de yDcpS sensible a la estructura secundaria del ARN? R: Sí. Los extremos 5' hundido o romos se descapsulan con menor eficiencia que los extremos monocatenarios o que sobresalen en 5'. Sin embargo, la interferencia estructural se puede superar mediante el uso de más enzima, temperaturas de incubación más altas o tiempos de incubación más prolongados. P: ¿Cuáles son las condiciones de tampón preferidas para yDcpS? R: El pH óptimo para yDcpS está entre 6 y 7. El tampón fosfato interfiere con la actividad de yDcpS. La actividad de yDcpS se reduce en tampones que contienen ≥100 mM de NaCl o ≥50 mM de KCl. P: ¿Es yDcpS activo a temperaturas superiores a 37 °C? R: Sí. Se ha confirmado la actividad de yDcpS hasta 50 °C.