New England Biolabs, M0464S, OGG termoestable

Categorías relacionadas Enzimas de reparación de ADN y endonucleasas específicas de la estructura Definición de la unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para escindir 10 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 60 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de 8-oxoguanina emparejada con una citosina en un volumen de reacción total de 10 μl en 1 hora a 65 °C. Condiciones de reacción 1X tampón rCutSmart™ Incubar a 65 °C 1X tampón rCutSmart™ Acetato de potasio 50 mM Tris-acetato 20 mM Acetato de magnesio 10 mM Albúmina recombinante 100 µg/ml (pH 7,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 10 mM NaCl 500 mM EDTA 0,1 mM DTT 1 mM 200 µg/ml Albúmina recombinante Glicerol al 50 % pH 7,4 a 25 °C Preguntas frecuentes P: ¿Cuál es la diferencia entre OGG termoestable (NEB n.º M0464) y Fpg (NEB n.º M0240)? R: Tanto Fpg como OGG termoestable son glicosilasas bifuncionales, lo que significa que la actividad de la glicosilasa primero reconoce y elimina la base modificada en el ADN, luego una actividad de la AP-liasa escinde la estructura principal del ADN. La OGG termoestable, a diferencia de FPG, es termoestable (activa a temperaturas de hasta 80 °C) y, si bien ambas enzimas tienen una especificidad de sustrato similar (ambas reconocen y cortan la 8-oxoguanina), escinden la estructura principal del ADN de forma diferente. La OGG termoestable corta el enlace 3' a una base de 8-oxoguanina. Esto deja una muesca en el sustrato del ADN con un fosfato 5' y un aldehído 3'-fosfo-α, β-insaturado. Fpg corta tanto 5' como 3' a la base modificada. La base modificada flota, creando un espacio de 1 nucleótido en el ADN con los extremos fosfato 5' y 3'. P: ¿Cuál es la actividad de Thermostable OGG en otros tampones? R: Thermostable OGG tiene actividad en los siguientes tampones: NEBuffer r1.1=100% de actividad NEBuffer r2.1=75% de actividad NEBuffer r3.1=50% de actividad rCutSmart Buffer=100% de actividad Thermopol Buffer=100% de actividad P: ¿Thermoestable OGG cortará una 8-oxoguanina emparejada con una base distinta a la citosina? R: Mientras que Thermostable OGG escinde preferentemente en la base modificada (8-oxoG) cuando está emparejada con la citosina (C), la enzima escindirá en la 8-oxoG independientemente de qué base esté emparejada con la 8-oxoguanina. P: ¿Cuál es el peso molecular de Thermostable OGG? R: El peso molecular de Thermostable OGG es 31.376 Da. P: ¿Thermoestable OGG es una proteína marcada? R: Sí, la enzima termoestable OGG contiene una etiqueta de hexa-histidina en el extremo C-terminal. P: ¿Qué sustrato se utiliza para analizar la enzima termoestable OGG? R: Los sustratos utilizados para analizar la actividad enzimática se enumeran en la definición de unidad de cada enzima. La enzima termoestable OGG se analiza utilizando un dúplex de oligonucleótidos de 60 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de 8-oxoguanina emparejada con citosina. P: ¿La enzima termoestable OGG corta solo una hebra o ambas para provocar una rotura bicatenaria? R: La enzima termoestable OGG corta solo la hebra dañada. Si ambas hebras están dañadas, las corta. P: ¿Qué bases modificadas reconocerá y escindirá la enzima termoestable OGG? R: La enzima termoestable OGG reconoce y escinde específicamente la 8-oxoguanina. No corta otras bases modificadas, como la 8-oxoadenina, la 5-hidroxicitosina, el 5-hidroxiuracilo ni el timinoglicol. P: ¿El OGG termoestable corta la 8-oxoguanina en el ADN monocatenario (ssADN)? R: Sí, el OGG termoestable corta el ADN monocatenario que contiene 8-oxoguanina; sin embargo, la actividad en el ADN monocatenario se reduce significativamente (aproximadamente 32 veces) en comparación con la actividad en un sustrato de ADN bicatenario (dsADN). P: ¿A qué temperaturas es activo el OGG termoestable? R: El OGG termoestable es activo entre 25 y 80 °C; sin embargo, su actividad óptima se observa entre 65 y 75 °C. Temperatura (°C) Unidades/ml 16 1000 25 1000 37 2500 42 4500 50 5500 60 7000 65 8000 70 8000 75 8000 80 6000 La actividad a diferentes temperaturas se basa en el ensayo de definición de unidad: La cantidad de enzima necesaria para escindir 10 pmol de un dúplex de oligonucleótidos de 60 meros marcado con fluorescencia que contiene una única base de 8-oxoguanina emparejada con citosina en un volumen de reacción total de 10 μl en 1 hora.