New England Biolabs, M0466L, Mezcla de enzimas RT de cambio de plantilla

La mezcla enzimática de RT con cambio de plantilla y el tampón de reacción que la acompaña permiten una actividad eficiente de cambio de plantilla en una reacción de transcripción inversa. La mezcla contiene una RT única y un inhibidor de ARNasa murino. A diferencia de los productos de RT de la competencia, no se requieren aditivos (como PEG o betaína) para un rendimiento óptimo, lo que simplifica la configuración de la reacción. Junto con un oligonucleótido de cambio de plantilla (TSO), se sintetiza ADNc con una secuencia conocida de elección unida al extremo 3'. El ADNc resultante puede amplificarse por PCR o servir como plantilla para 5' RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc) o 2 Categorías relacionadas: Síntesis de ADNc y transcriptasas inversas, PCR, qPCR y tecnologías de amplificación Aplicaciones: Síntesis de ADNc, Transcripción inversa (síntesis de ADNc) Especificación: Inactivación por calor a 80 °C Preguntas frecuentes : P: ¿Necesito añadir un inhibidor de ARNasa a la reacción de RT cuando uso la mezcla enzimática de RT con cambio de plantilla? R: La mezcla enzimática para RT de cambio de plantilla contiene inhibidor de ARNasa murino. Si el material de partida es ARN, no se requiere inhibidor de ARNasa adicional. Si el material de partida son células/tejidos, siga las instrucciones para la lisis celular o el aislamiento de ARN, que pueden requerir inhibidor de ARNasa. P: Numerosas publicaciones describen la adición de diversos aditivos (p. ej., betaína y PEG) para mejorar el cambio de plantilla. ¿Puedo añadir alguno de ellos a mi reacción? R: La mezcla enzimática y el tampón para RT de cambio de plantilla se han optimizado ampliamente para el cambio de plantilla. Dado que este desarrollo ya se ha realizado, generalmente observamos el mejor rendimiento en los reactivos proporcionados. P: ¿Es la mezcla enzimática para RT de cambio de plantilla compatible con cebadores de RT con bases degeneradas para la síntesis y amplificación de ADNc, como se describe en el método mcSCRB [1]? R: Hemos comparado el rendimiento de la mezcla enzimática para RT de cambio de plantilla y la transcriptasa inversa Maxima H Minus (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas de ADNc generadas con la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla NEB contienen al menos un 10 % más de transcripciones que las generadas con Maxima H Minus suplementado con 7,5 % de PEG, como se describe en el método mcSCRB. Además, las bibliotecas NEB mostraron métricas mejoradas de distribución de bases de ARN, como se indica a continuación: Opciones de RT % Exón % ARNr % Intrón % Intergénico NEB 77,8 ± 0,3 2,1 ± 0,3 10,3 ± 0,0 9,7 ± 0,0 mcSCRB 50,0 ± 1,8 24,8 ± 1,8 9,8 ± 0,2 15,4 ± 0,2 1 Bagnoli, JW. et al. (2018) Nat Commun. 2937-2944. P: ¿Qué tipos de oligonucleótidos de cambio de plantilla (TSO) son compatibles con la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla? R: En general, se pueden usar diferentes TSO, incluyendo aquellos con modificaciones en el extremo 5', como biotina, bases isoméricas o espaciadores abásicos. Recomendamos un TSO con rGrGrG en el extremo 3' para una transferencia de plantilla eficiente, pero varios tipos/secuencias de TSO son compatibles con la mezcla enzimática de RT para transferencia de plantilla. Tenga en cuenta que para la amplificación posterior con polimerasas de tipo B de la familia arqueal (p. ej., Q5® y Phusion®), un TSO que contenga residuos de rU puede causar inhibición. Para una aplicación específica, consulte la Guía General/TSO en el protocolo correspondiente. P: ¿Puedo usar la mezcla enzimática de RT para transferencia de plantilla en reacciones de RT regulares? R: Este producto también se puede usar en una reacción de síntesis de primera cadena más general omitiendo el TSO, pero es probable que otros productos sean más adecuados para estas reacciones. Para conocer los productos recomendados por aplicación, visite: https://www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/cdna-synthesis-selection. P: ¿Cuál es la eficiencia del cambio de plantilla al usar la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla? R: La eficiencia del cambio de plantilla varía según las secuencias diana. Normalmente observamos una eficiencia entre el 20-60% medida por qPCR. P: ¿Funciona la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla para ARN procariota? R: Sí, la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla se puede aplicar al ARN procariota. Sin embargo, la eficiencia del cambio de plantilla para ARN procariota, cuyos transcritos primarios contienen 5'-PPP, será menor en comparación con el ARNm eucariota con una estructura de capuchón. P: ¿Funciona la mezcla enzimática de RT de cambio de plantilla para ARN fragmentado? R: La idoneidad del ARN fragmentado como material de partida dependerá de la aplicación/pregunta de interés. Para la síntesis de ADNc de 5′ RACE y de segunda cadena, se requieren ARN intactos para conservar el sitio de inicio de la transcripción completo. Para la amplificación de ADNc, se puede usar ARN fragmentado como entrada; sin embargo, la eficiencia de cambio de molde es menor para los ARN sin estructura de capuchón. P: ¿Qué tipo de cebadores de RT se pueden usar con la mezcla enzimática de RT para cambio de molde? R: En general, los cebadores de RT pueden ser poli(dT), hexámeros aleatorios o específicos de genes. Para la amplificación de ADNc, el cebador de RT debe contener un identificador de PCR de secuencia conocida para la amplificación posterior de ADNc mediante PCR. P: ¿Puedo reducir el tiempo de reacción de RT? R: No se recomienda reducir el tiempo de reacción de RT, ya que probablemente disminuirá la producción del producto de ADNc deseado.