New England Biolabs, M0467S, Ligasa de ADN Salt-T4®

¿Busca formulaciones y variantes adicionales de la ADN ligasa T4? Categorías relacionadas: Aplicaciones de las ADN ligasas: BioBrick®, Ensamblaje, Clonación, Ligación, NEBridge® Golden Gate, Especificación del ensamblaje. Definición de la unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para obtener una ligación del 50 % de 6 µg de ADN Lambda-HindIII en 30 minutos a 25 °C en un volumen total de reacción de 20 µ en tampón de reacción de ADN ligasa T4 1X suplementado con 100 mM de NaCl. Condiciones de reacción 1X Tampón de reacción de la ligasa del ADN T4 Incubar a 25 °C Tampón de reacción de la ligasa del ADN T4 50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2 1 mM ATP 10 mM DTT (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 50% glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor 65 °C durante 10 minutos Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son algunas de las causas del fallo de la reacción de ligación que pueden provocar un fallo de la transformación? R: La ligación falló porque no había ATP o Mg2+. Utilice el tampón suministrado o añada ATP a un tampón compatible. El ATP en tampones de más de un año puede haberse degradado lo suficiente como para causar problemas. Al complementar con ATP, asegúrese de utilizar riboATP, ya que el desoxirriboATP no funcionará. La ligadura falló debido a la presencia de EDTA en la reacción. Limpie el ADN (recomendamos los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch®). CIP, BAP, fosfatasa antártica o SAP no se inactivan por completo tras el paso de desfosforilación. Siga el procedimiento recomendado para eliminar la fosfatasa. La concentración fue demasiado alta, lo que provocó que la ligadura solo produjera ADN lineal. Mantenga la concentración total de ADN entre 1 y 10 μg/ml. El inserto y el plásmido no contienen fosfatos. Nota: es posible que los cebadores no contengan fosfatos, lo que impide la ligadura de extremos romos con vectores tratados con CIP. Solicite cebadores con fosfatos o fosforile los cebadores con polinucleótido quinasa T4 antes de usarlos. Se añadió demasiada mezcla de ligadura a las células. Añada entre 1 y 5 μl a 50 μl de células competentes. El inserto era grande y las condiciones no permitían la circularización. Reduzca la concentración del inserto. La ligasa estaba inactiva. Pruebe con ADN Lambda HindIII u otro sustrato adecuado. La mezcla de ligadura contenía PEG y se incubó durante la noche. La ligadura prolongada con PEG disminuye la eficiencia de la transformación. Esto podría deberse a la producción gradual de grandes fragmentos lineales de ADN que pueden inhibir la transformación. El tampón de ligasa de ADN StickTogether™ contiene PEG. La mezcla de ligadura no se purificó antes de la electroporación. Debe eliminarse el tampón o la sal generará una chispa. Dialice la muestra o utilice una columna de centrifugación para purificarla (recomendamos los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch). El PEG del tampón de ligasa de ADN StickTogether™ previene la chispa, pero también la electroporación. El PEG debe eliminarse mediante una columna de centrifugación. P: ¿Cuándo se debe elegir la enzima Salt-T4 ADN Ligasa? R: Mientras que la T4 ADN Ligasa es sensible a la presencia de sal en la reacción, la Salt-T4 ADN Ligasa puede tolerar concentraciones de sal de hasta 500 mM para la ligadura de extremos cohesivos o de hasta 150 mM para la ligadura de extremos romos. Por lo tanto, la Salt-T4 DNA Ligasa debe ser la enzima de elección si la ligadura se va a realizar en un tampón que contenga sal (p. ej., NEBuffer 3.1) o si el arrastre de sal (de las preparaciones de ADN) es una preocupación. Tenga en cuenta que en presencia de PEG (tampón 1X StickTogether™ DNA Ligasa), el ADN en una solución con alto contenido en sal precipitará, inhibiendo la ligadura. Si desea ligar ADN en presencia de sal superior a 100 mM, recomendamos el uso del tampón 1X T4 DNA Ligasa. P: ¿Qué tampón debo usar con la Salt-T4 DNA Ligasa? R: Si intenta ligar extremos cohesivos o extremos romos en presencia de >100 mM de sal, recomendamos usar la Salt-T4 DNA Ligasa en el tampón 1X T4 DNA Ligasa. Si intenta ligar extremos romos o salientes de una sola base, debe usarse la Salt-T4 DNA Ligasa en el tampón StickTogether™ DNA Ligasa. No recomendamos suplementar el tampón de ligasa de ADN StickTogether™ con sal > 100 mM, ya que el PEG presente en el tampón y el ADN precipitará, inhibiendo la ligación. Si se intenta ligar ADN en presencia de sal > 100 mM, recomendamos usar tampón de ligasa de ADN T4 1X. No detenga la reacción con calor, ya que el tratamiento térmico del PEG en el tampón de ligasa de ADN StickTogether™ inhibirá la transformación. P: ¿Cuál es la actividad de la ligasa de ADN Salt-T4 en otros tampones? R: La ligasa de ADN Salt-T4 es 100 % activa en el tampón de ligasa de ADN T4 suplementado con NaCl 100 mM, NEBuffer r3.1 y HiFi Taq DNA Ligase Buffer (cuando se suplementa con ATP). La ligasa de ADN Salt-T4 tiene una actividad reducida en otros tampones de enzimas de restricción NEB y ligasas; sin embargo, la actividad en estos tampones se puede restaurar al suplementarse con NaCl 100 mM. Actividad % del tampón1 Tampón de ligasa de ADN T4 suplementado con 100 mM de NaCl 100 % Tampón de ligasa de ADN T4 25 % Tampón NE r1.12 25 % Tampón NE r1.12 suplementado con 100 mM de NaCl 100 % Tampón NE r2.12 50 % Tampón NE r2.12 suplementado con 100 mM de NaCl 100 % Tampón NE r3.12 100 % Tampón rCutSmart®2 25 % Tampón rCutSmart2 suplementado con 100 mM de NaCl 100 % Tampón Taq de ligasa de ADN2 25 % Tampón HiFi Taq de ligasa de ADN2 100 % 1Actividad relativa a la actividad en un sustrato de extremo cohesivo en tampón de ligasa de ADN T4 suplementado con 100 mM de NaCl (25 °C durante 10 minutos). 2 Suplementado con 1 mM de ATP. Asegúrese de usar riboATP (NEB n.° P0756), ya que el desoxirriboATP no funcionará. Para ver su porcentaje de actividad funcional en CutSmart y el de otras enzimas modificadoras de ADN en el proceso de clonación, consulte la tabla de actividad de las enzimas modificadoras de ADN en el tampón rCutSmart®. P: ¿Se puede inactivar esta ligasa por calor? R: Sí, al igual que la ADN ligasa T4, esta ligasa se puede inactivar por calor durante 10 minutos a 65 °C. No la inactive por calor si hay PEG en el tampón de reacción (tampón de ADN ligasa StickTogether™), ya que se inhibirá la transformación. P: ¿Cuál es la diferencia entre las definiciones de unidad de la ADN ligasa T4 (NEB n.° M0202) y la ADN ligasa Salt-T4 (NEB n.° M0467)? R: Tanto la unidad de ADN ligasa T4 como la de ADN ligasa Salt-T4 se definen como una ligadura del 50 % de fragmentos HindIII de 0,12 μM. Sin embargo, el tiempo/temperatura de incubación, las condiciones del tampón y el método de detección de los productos de la ligadura difieren. La unidad de ADN ligasa T4 se determina después de 30 minutos a 16 °C, mientras que la unidad de ADN ligasa Salt-T4 se determina después de 10 minutos a 25 °C. La ADN ligasa T4 Salt-T4 y la ADN ligasa T4 tienen la misma actividad específica (1 unidad de ADN ligasa Salt-T4 en tampón de ADN ligasa T4 1X + NaCl 100 mM = 1 unidad de ADN ligasa T4 en tampón de ADN ligasa T4 1X). P: ¿Cuánto ADN se debe utilizar en una ligadura con esta ligasa? R: La unidad utiliza 6 μg de fragmento HindIII. Esta alta concentración de ADN se puede utilizar para la ligadura del enlazador. Para promover la formación de círculos, útil en la transformación, se debe utilizar una concentración total de ADN más baja. La concentración general de vector + inserto debe estar entre 1-10 μg/ml para una ligadura eficiente. Se recomiendan proporciones molares de vector:inserto entre 1:1 y 1:10 (1:3 es lo típico). Si no está seguro de sus concentraciones de ADN, realice múltiples ligaduras con proporciones variables. P: ¿Tiene la ADN ligasa Salt-T4 una mayor tolerancia a la sal que otras ligasas? R: Sí. Mientras que la ADN ligasa T3 puede tolerar concentraciones de sal de hasta 250-300 mM en la reacción, la ADN ligasa Salt-T4 puede tolerar concentraciones de sal de hasta 500 mM en la reacción para la ligadura de extremos cohesivos y concentraciones de sal de hasta 150 mM para la ligadura de extremos romos. Tenga en cuenta que en presencia de PEG (p. ej., StickTogether™ DNA Ligase Buffer), el ADN en una solución alta en sal precipitará, inhibiendo la ligadura. Si desea ligar ADN en presencia de >100 mM de sal, recomendamos el tampón 1X T4 ADN Ligasa. P: ¿Se puede utilizar directamente la reacción de ligación producida por la Salt-T4 ADN Ligasa para transformar células electrocompetentes? R: Recomendamos purificar la reacción de ligación antes de la electroporación. Es necesario eliminar el tampón o se generará una chispa debido a la sal presente. Dialice la muestra o utilice una columna de centrifugación para purificarla (recomendamos los kits de purificación de ácidos nucleicos Monarch). El PEG del tampón StickTogether™ ADN Ligasa previene la chispa, pero también la electroporación, por lo que debe eliminarse mediante una columna de centrifugación.