New England Biolabs, M0470T, ARN polimerasa Hi-T7® (alta concentración)

La ARN polimerasa Hi-T7 está diseñada para Categorías relacionadas Síntesis de ARN Transcripción in vitro (IVT), Soluciones de nucleótidos para aplicaciones de ARN Amplificación mediada por transcripción y NASBA Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para incorporar 1 nmol de ATP en material insoluble en ácido en 1 hora a 50 °C Condiciones de reacción Tampón de reacción de ARN polimerasa Hi-T7® 1X Incubar a 50 °C Tampón de reacción de ARN polimerasa Hi-T7® 1X Tris-HCl 40 mM MgCl2 4 mM NaCl 50 mM espermidina 2 mM DTT 1 mM (pH 7,5 a 25 °C) Tampón de almacenamiento Tris-HCl 50 mM NaCl 100 mM EDTA 1 mM DTT 50 % glicerol 0,1 % (p/v) Triton® X-100 pH 7,9 a 25 °C Unidad Condiciones de ensayo 1X Tampón de reacción de ARN polimerasa Hi-T7, suplementado con 0,5 mM de cada uno de ATP, UTP, GTP, CTP y 1 µg de ADN de fago T7 en 50 μl de volumen de reacción. Preguntas frecuentes P: ¿Puedo usar un tampón de reacción diferente para la transcripción in vitro con ARN polimerasa Hi-T7? R: No. El tampón de reacción de ARN polimerasa Hi-T7 ha sido formulado específicamente para funcionar con ARN polimerasa Hi-T7. P: ¿Reconoce la ARN polimerasa Hi-T7 la misma secuencia promotora que la ARN polimerasa T7 de tipo silvestre del bacteriófago? R: Sí. Las ARN polimerasas Hi-T7 y T7 reconocen el mismo promotor: 5′ TAATACGACTCACTATAG 3′ con transcripción comenzando en la G. La primera base en la transcripción será una G. P: ¿A qué temperatura es activa la ARN polimerasa Hi-T7? R: La ARN polimerasa Hi-T7 es activa entre 37 °C y 56 °C. Cuando se realizan reacciones de transcripción a temperaturas superiores a los 50 °C sugeridos, se recomienda limitar el tiempo de reacción a 30 minutos o menos, ya que la incubación de ARN a alta temperatura durante períodos prolongados en presencia de MgCl2 (un componente del tampón de reacción de la ARN polimerasa Hi-T7) puede conducir a la degradación del ARN. P: ¿Cuáles son las principales causas del fracaso de la reacción cuando se utiliza la ARN polimerasa Hi-T7? R: La pureza de la plantilla de ADN es muy importante y debe prepararse mediante métodos de purificación como la columna de centrifugación o la extracción con fenol:cloroformo. Además, para evitar la contaminación por ARNasa, recomendamos usar guantes, usar puntas con filtro y tubos sin ARNasa. Es importante mezclar bien los componentes de la reacción después de descongelarlos y configurar la reacción a temperatura ambiente en el orden indicado en el protocolo para obtener un rendimiento óptimo. P: ¿Qué plantillas se pueden usar para la transcripción in vitro con la ARN polimerasa Hi-T7? R: El ADN bicatenario que se puede usar como plantilla con la ARN polimerasa Hi-T7 incluye plásmidos linealizados, productos de PCR u oligos complementarios hibridados que contienen la secuencia promotora T7. P: ¿Puede la ARN polimerasa Hi-T7 transcribir a partir de un plásmido sin cortar? R: Sí. La ARN polimerasa Hi-T7 transcribirá alrededor de una plantilla circular varias veces sin disociarse. Para transcribir un ARN de una longitud específica, el plásmido se puede linealizar con una enzima de restricción que deja un saliente romo o 5′ aguas abajo del ADN de interés.