New England Biolabs, M0490L, EpiMark® Hot Start Taq ADN polimerasa

ADN polimerasa optimizada para análisis epigenético Categorías relacionadas Análisis de la metilación del ADN por conversión de bisulfito, Análisis del metiloma, Análisis de la metilación del ADN, Aplicaciones Secuenciación de bisulfito, PCR de inicio en caliente, PCR especializada, Especificación Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 15 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 75 °C. Condiciones de reacción 1X EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack 1X EpiMark® Hot Start Taq Reaction Buffer Pack 20 mM Tris-HCl 1,8 mM MgCl2 22 mM KCl 0,06 % IGEPAL® CA-630 0,05 % Tween® 20 22 mM NH4Cl (pH 8,9 a 25 °C) Tampón de almacenamiento 10 mM Tris-HCl 100 mM KCl 1 mM DTT 0,1 mM EDTA 0,5 % Tween® 20 0,5 % IGEPAL® CA-630 50 % Glicerol pH 7,4 a 25 °C Inactivación por calor No Peso molecular Teórico: 94000 daltons Exonucleasa 5' - 3' Sí Exonucleasa 3' - 5' No Unidad Condiciones del ensayo: Tampón de reacción ThermoPol® 1X, 200 µM de dNTP, incluyendo [3H]-dTTP y 15 nM de ADN M13 cebado. Preguntas frecuentes : ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad intrínseca de la polimerasa de Taq añade un 3'A sin plantilla, mientras que la actividad de la exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debería usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Warm Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas. El rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiendo de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A sin corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede resultar en la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, que luego se podían añadir a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar las actividades enzimáticas: Hot Start Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de productos para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: ¿Cómo debo determinar la temperatura de hibridación adecuada para mi reacción? R: La temperatura de hibridación óptima (Ta) para un par de cebadores se puede determinar empíricamente mediante una PCR en gradiente. Utilice la calculadora de Tm de NEB para determinar la temperatura de annealing inicial para su par de cebadores y la polimerasa/tampón NEB que se utilizará. A diferencia de otras calculadoras, la calculadora de Tm de NEB considera los componentes del tampón que afectan las temperaturas de fusión y las observaciones empíricas al calcular la temperatura de annealing óptima. Otras calculadoras en línea pueden subestimar la mejor temperatura de annealing para la polimerasa Q5. Para obtener más información sobre el uso de una única temperatura de annealing (es decir, "universal"), consulte nuestra nota de aplicación: Temperatura de annealing universal en PCR y su impacto en los resultados de amplificación. Más información. Una PCR eficiente es un equilibrio dinámico de sustancias químicas y reactivos que promueven la interacción de un cebador específico con su complemento en el molde a la temperatura de annealing seleccionada. Si bien las temperaturas de annealing son valores constantes seleccionados por el científico, las temperaturas de fusión entre cada cebador y el molde pueden variar de un amplicón a otro. Definiciones. Nota: esta sección trata específicamente sobre el annealing de un cebador de oligonucleótidos a un molde de ADN. Durante el paso de desnaturalización de la PCR, la alta temperatura separa el dsADN molde en ssADN, revelando secuencias de nucleótidos complejas que permiten la hibridación (unión, hibridación, asociación) de un cebador oligonucleótido monocatenario complementario a una temperatura más baja. La temperatura de hibridación (TA) es la temperatura utilizada durante el paso de hibridación del cebador de una PCR, que depende de la temperatura de fusión del cebador. La temperatura de fusión (TM) de un cebador es la temperatura a la que el 50% del cebador está unido a su complemento perfecto y el 50% está libre en solución debido a la disociación ("fusión") de su complemento. ¿Por qué es importante usar la temperatura de hibridación correcta para una PCR exitosa? La temperatura de hibridación de una reacción suele ser inferior a la temperatura de fusión para garantizar la hibridación del cebador con el molde. Si la temperatura de hibridación es demasiado alta, el cebador no se hibridará con el molde y la amplificación no continuará. Si la temperatura de annealing es demasiado baja, puede ocurrir una unión no específica del cebador(es) a la plantilla o entre sí (dímeros de cebador), causando: Mayor probabilidad de formación de producto no específico. Disminución de la formación del producto deseado debido a condiciones de reacción ineficientes. Reactivos de PCR que influyen en la temperatura de fusión del cebador y la temperatura de annealing de la reacción Las temperaturas de fusión no son valores constantes en una PCR y están influenciadas por varios factores: Longitud del cebador y proporción de guanina y citosina en relación con adenina y timina (% contenido de GC) Dicta la cantidad de enlaces de hidrógeno entre el cebador y su complemento. Cuanto mayor sea el enlace de hidrógeno (mayor Tm) de un cebador a su plantilla, más energía se necesita para romper esos enlaces (mayor temperatura). Concentración del cebador La temperatura de fusión de los cebadores en una PCR está determinada por las especies de ADN en exceso molar, que deberían ser los cebadores. Magnesio y dNTPs La concentración libre de iones magnesio [Mg2+] determina la temperatura de fusión de un dúplex de ADN, pero el magnesio puede ser secuestrado por los reactantes y productos de la PCR. La carga positiva del magnesio quela los fosfatos cargados negativamente de los dNTP, cebadores y ssDNA. La reducción de las repulsiones electrostáticas (entre el cebador y los fosfatos del ssDNA) aumenta la concentración del cebador. Concentración de cationes monovalentes (Na+, K+) Los cationes monovalentes apoyan la estabilidad del dúplex de ADN, de forma similar a los iones magnesio. Los cationes monovalentes y los iones magnesio compiten por la unión al ADN. El aumento de la concentración de cationes monovalentes disminuye la unión del magnesio al ADN. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación no específica, sin amplificación, tamaño de producto incorrecto ¿Resultado curioso? Consulte nuestra Guía de resolución de problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la optimización de PCR con ADN polimerasas termófilas y en esta entrada del blog. El soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, En condiciones óptimas, suele observarse una mancha o un alto nivel de fondo. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima. Reduzca la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la recomendada por el protocolo específico del producto. Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; pruebe con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación. Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos. Si, además de la mancha, se observa un halo iluminado alrededor del pocillo, use menos plantilla. P: ¿Cuál debería ser la concentración final del cebador en mi PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR RECOMENDADA (CADA UNO) RANGO DE CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR (CADA UNO) Polimerasas Q5® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas Phusion® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas OneTaq® 200 nM 50-1000 nM Polimerasas Taq 200 nM 50-1000 nM Hemo KlenTaq 300 nM 50-1000 nM Polimerasas LongAmp® 400 nM 50-1000 nM Recomendamos una concentración final de cebador de 500 nM cuando se utilizan polimerasas Q5 y ​​Phusion debido a su alta actividad de exonucleasa 3´-5´. Recomendamos una concentración final de cebador de 200 nM al utilizar polimerasas basadas en Taq, como OneTaq y EpiMark®. Consulte los protocolos específicos en las páginas de los productos para obtener información sobre las recomendaciones de rango. Más información Las polimerasas de la familia B de Archaeal, como Q5 y ​​Phusion, poseen una fuerte actividad exonucleasa 3'-5', que puede digerir nucleótidos en el extremo 3' de los cebadores y aumentar la probabilidad de amplificación inespecífica. En comparación con las polimerasas de la familia A, como Taq y OneTaq, una mayor concentración final de cebador compensa estos efectos y promueve la formación de productos específicos. Generalmente, una PCR eficiente requiere proporciones óptimas de magnesio, otros iones y cebadores para promover la especificidad mediante la estabilización de las cargas negativas en la cadena principal de fosfato. Si bien la composición de las ADN polimerasas Q5 y ​​Phusion es exclusiva, sus tampones están optimizados para usar una concentración final de cebador de 500 nM. P: ¿Es esta ADN polimerasa Taq compatible con otros tampones NEB? A: Nombre del producto Polimerasa TaqDNA de inicio en caliente Polimerasa TaqDNA con tampón estándar Polimerasa TaqDNA con tampón estándar (sin Mg) Polimerasa TaqDNA con tampón ThermoPol Polimerasa EpiMark® Hot Start Número de producto M0495 M0273 M0320 M0267 M0490 Tampón suministrado Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción Taq estándar (sin Mg) Tampón de reacción con 25 mM de MgCl2 Tampón de reacción ThermoPol® EpiMark® Hot Start Taq Composición del tampón suministrado a 1X (concentración final de la reacción) 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1,5 mM MgCl2 (pH 8,3 a 25 °C) 10 mM Tris-HCl 50 mM KCl 1,5 mM MgCl2 pH 8,3 a 25 °C 0 mM Tris-HCl 50 mM KCl pH 8,3 a 25 °C 20 mM Tris-HCl 10 mM (NH4)2SO4 10 mM KCl 2 mM MgSO4 0,1 % Triton ® X-100 pH 8,8 a 25 °C 20 mM Tris-HCl 1,8 mM MgCl2 22 mM KCl 0,06 % IGEPAL® CA-630 0,05 % Tween ® 20 22 mM NH4Cl (pH 8,9 a 25 °C) Otros tampones compatibles *No se recomienda su uso en rCutSmart™ ni otros NEBuffers* Tampón de reacción ThermoPol® Tampón de reacción estándar OneTaq ® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción ThermoPol® Tampón de reacción estándar OneTaq® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción estándar OneTaq® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción Taq estándar Tampón de reacción estándar One® Tampón de reacción Taq LongAmp® Tampón de reacción ThermoPol® Tampón de reacción Taq estándar P: ¿Cuáles son las recomendaciones generales para diseñar cebadores para ADN tratado con bisulfito/desaminado? R: Recomendamos diseñar cebadores oligonucleótidos largos (~26-35) para amplificar ADN tratado con bisulfito/desaminado. Debido a que el ADN con bisulfito a menudo se daña, es más útil diseñar dianas entre 150-500 pb. Tenga en cuenta que, dado que las cadenas de ADN ya no son complementarias después del tratamiento con bisulfito/desaminación, un conjunto de cebadores individual solo amplificará una cadena de la secuencia diana. El primer cebador debe diseñarse para anelaarse a la secuencia diana convertida. El segundo cebador debe diseñarse para anelaarse al producto de extensión del primer cebador, no a la cadena molde opuesta, como sería el caso en la PCR tradicional. Se recomiendan cebadores con temperaturas de annealing más altas (>60 °C, según lo determinado por la calculadora de Tm de NEB) para un rendimiento óptimo. Si es necesario, incluya tantas guaninas como sea posible en la región de cebado o añada bases adicionales para aumentar la Tm. Los cebadores más largos también aumentarán la especificidad. Idealmente, se deben evitar los sitios CpG; si es esencial, inclúyalos en el extremo 5' del cebador y sintételos con una base mixta (Y = C/T, R = G/A) en la posición de la citosina. Se pueden utilizar programas informáticos como MethPrimer, methBLAST o BiSearch para diseñar o analizar cebadores. Los mejores resultados se obtienen típicamente al utilizar cada cebador a una concentración final de 0,5 µM en la reacción.