New England Biolabs, M0493S, ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® Hot Start

Este producto está disponible en un formato sin glicerol. Aplicaciones PCR de inicio en caliente, PCR de largo alcance, PCR rápida, Especificación Materiales necesarios pero no suministrados Mezcla de solución de desoxinucleótidos (dNTP) (NEB n.º N0447) Agua sin nucleasas (NEB n.º B1500) Definición de unidad Una unidad se define como la cantidad de enzima que incorporará 10 nmol de dNTP en material insoluble en ácido en 30 minutos a 74 °C. Inactivación por calor Sin unidad Condiciones del ensayo TAPS-HCl 25 mM (pH 9,3 a 25 °C), KCl 50 mM, MgCl 2 2 mM, β-mercaptoetanol 1 mM, dNTP 200 μM que incluyen [3H]-dTTP y ADN M13 cebado 15 nM. Preguntas frecuentes P: ¿Cuáles son las ventajas de utilizar la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5®? A: Alta fidelidad significa bajas tasas de error, secuencias más precisas La ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 tiene una tasa de error ultrabaja (<1 error por millón de bases) debido a una fuerte actividad de exonucleasa de corrección de pruebas (3'-5'), lo que la convierte en la polimerasa preferida para todas las aplicaciones de PCR que requieren mayor precisión (alta precisión de secuencia) o la amplificación de plantillas difíciles (desde AT alta hasta GC alta). Alta procesividad significa amplicones más largos, más rápidos La polimerasa de alta fidelidad Q5 se fusiona al dominio de unión al ADN Sso7d que mejora la procesividad, lo que mejora la velocidad, la fidelidad y la confiabilidad del rendimiento. Esta mayor fidelidad y procesividad permite una amplificación de plantilla más precisa y más larga (hasta 10 kb de ADNg, 20 kb de plásmido). Más información Fidelidad mejorada La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla. Un aspecto crítico de la fidelidad es la capacidad de la ADN polimerasa para leer la cadena molde, seleccionar el nucleósido trifosfato adecuado e insertar el nucleótido correcto en el extremo 3' del dominio catalítico de la polimerasa, de modo que se mantenga el apareamiento de bases Watson-Crick canónico. Las polimerasas de alta fidelidad muestran una preferencia de unión significativa por el nucleótido trifosfato correcto frente al incorrecto durante la polimerización. La tasa de error de una polimerasa es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido con apareamiento incorrecto. Si un nucleótido incorrecto se une al sitio activo de la polimerasa, la incorporación se ralentiza debido a la arquitectura subóptima del complejo del sitio activo. Esto permite que el nucleótido incorrecto se disocie antes de la incorporación, lo que permite que el proceso se reinicie (y que se una un nucleótido trifosfato correcto). Además de una discriminación eficaz entre la incorporación de nucleótidos correctos e incorrectos en el sitio activo de la polimerasa, algunas ADN polimerasas poseen actividad exonucleasa correctora (3'→5'). Si después de un tiempo no se incorpora el nucleótido correcto, el extremo 3' de la cadena de ADN en crecimiento se mueve a este dominio de exonucleasa 3'→5' donde se rompe el enlace fosfodiéster entre el nucleótido incorrecto y el nucleótido anterior, liberando el nucleótido incorrecto y permitiendo que la cadena regrese al dominio de la polimerasa, donde la polimerización puede continuar con el nucleótido correcto. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación, incluyendo: Clonación/subclonación a partir de material amplificado in vitro (PCR, RCA, etc.) para expresión de proteínas o estudios genéticos Análisis de SNP por clonación y secuenciación Análisis de ARN por RT-PCR Secuenciación de próxima generación La fidelidad es menos importante: Si el producto amplificado por PCR se secuencia directamente mediante secuenciación Sanger (sin un paso de clonación intermedio), donde la señal es un promedio de los amplicones de entrada. Sin embargo, es más importante para las técnicas de secuenciación de próxima generación y de moléculas individuales. En aplicaciones de diagnóstico donde la lectura es la presencia o ausencia de un producto. Procesividad mejorada mediante la fusión con la proteína de unión al dsADN Sso7d. La procesividad es la capacidad de una polimerasa para replicar el ADN sin disociarse del molde y se mide por el número promedio de nucleótidos incorporados por evento de unión. Sso7d se une al dsADN, estabilizando la polimerasa de fusión al molde, incluso cuando este es difícil de alcanzar. Sso7d (de Sulfolobus solfataricus) es una proteína de unión al dsADN de 7 kDa, independiente de la secuencia. Las polimerasas de fusión con Sso7d permiten tiempos de extensión de PCR más cortos (lo que limita la amplificación inespecífica) y permiten el uso de menos enzima (rentable, con menos componentes del tampón de almacenamiento, como el glicerol) al aumentar la procesividad de la polimerasa. Por ejemplo, la polimerasa Pfu (Pyroccocus furiosis) (una polimerasa de la familia B de Archaeal, como Q5®) por sí sola exhibe una puntuación de procesividad de 0,84 con una longitud de extensión de cebador promedio de 6 nucleótidos, mientras que la proteína de fusión Pfu-Sso7d exhibe una procesividad más alta con una puntuación de 0,98 y una longitud de extensión promedio de 55 nucleótidos (3). (1) Johnson, KA (2010) Biochimica et Biophysica Acta, 1804, 1041–1048. PMID: 20079883 (2) Joyce, CM, y Benkovic, SJ (2004) Biochemistry, 43, 14317–14324. PMID: 15533035 (3) Wang, Y. et al. (2004) Nucleic Acids Res, 32, 1197-1207. PMID: 14973201 P: ¿Cuáles son las diferencias entre los numerosos productos de polimerasa Q5® disponibles? R: Las formulaciones de enzima independiente (NEB #M0491, #M0493) se recomiendan para una configuración flexible de PCR y para plantillas con alto contenido de GC (añadiendo el potenciador de GC a la reacción). Las formulaciones de mezcla maestra (NEB #M0492, #M0494) ofrecen la mayor comodidad al contener enzima, Mg₂, dNTP y todos los componentes del tampón necesarios para una amplificación robusta; solo es necesario añadir la plantilla y los cebadores. Las formulaciones de inicio rápido (NEB #M0493, #M0494) inhiben la actividad de la enzima, lo que permite una configuración de reacción cómoda a temperatura ambiente y son adecuadas para todas las aplicaciones de PCR que requieren mayor precisión, alta especificidad o la amplificación de dianas difíciles o largas. Para obtener más información sobre la tecnología de inicio rápido, haga clic aquí. Las formulaciones NEBNext® Q5 (NEB #M0541, #M0543, #M0544) se han optimizado específicamente para limitar el sesgo de GC durante la amplificación de bibliotecas NGS. M0544 es la mezcla maestra sugerida para aplicaciones NGS. La mezcla maestra Q5 Blood Direct 2X (NEB #M0500) está especialmente formulada para muestras de sangre sin necesidad de un paso de purificación. Es una enzima Hot Start. La polimerasa Q5 no puede leer ni incorporar uracilo, pero la ADN polimerasa Q5U® Hot Start de alta fidelidad (NEB #M0515) sí puede. Úsela con plantillas de ADN que contengan uracilo, convertidas con bisulfito, desaminadas o dañadas. La prevención de contaminación por arrastre se puede utilizar con Q5U y dUTP/dTTP. Es una enzima Hot Start. P: Mis resultados no son los esperados. ¿Dónde puedo encontrar ayuda para la resolución de problemas? R: Amplificación inespecífica, sin amplificación, tamaño de producto incorrecto. ¿Tiene curiosidad por el resultado? Consulte nuestra Guía de Solución de Problemas de PCR después de su reacción para identificar posibles causas de resultados inesperados y soluciones. Puede encontrar más detalles sobre las condiciones de reacción y la optimización de la configuración en nuestras Directrices para la Optimización de PCR con ADN Polimerasas Termófilas y en esta entrada del blog. El equipo de soporte técnico estará encantado de ayudarle a solucionar sus problemas de PCR. Si desea ayuda, puede: Enviarnos un correo electrónico a info@neb.com Llamar al soporte técnico al (800)-0632-7799, disponible de lunes a viernes, de 9:00 a. m. a 6:00 p. m., hora del este. Completar este formulario web. Error al amplificar un objetivo mayor a 5 kb. Si tiene dificultades para amplificar un objetivo mayor a 5 kb, pruebe algunos de estos consejos: Recomendamos usar polimerasas Q5®, Phusion® o LongAmp®. Si usa Q5, intente disminuir la concentración final del cebador a 150-300 nM. Las formulaciones independientes de enzima + tampón permiten mayor flexibilidad en la optimización de la reacción que las mezclas maestras. Use más plantilla. Trate la plantilla purificada con cuidado para no cortarla. Optimice la concentración de enzima probando una titulación de enzima en la reacción (reacciones de 0,25 a 2 unidades/50 μl). Aumente el número de ciclos. Alargue el tiempo de extensión a 40 s/kb. Untar en un gel de agarosa. Cuando las condiciones de PCR no son las adecuadas, En condiciones óptimas, suele observarse una mancha o un fondo alto. Pruebe una o más de las siguientes sugerencias: Use menos enzima. Reduzca la temperatura de extensión a 3 °C por debajo de la recomendada por el protocolo específico del producto. Por ejemplo, el protocolo OneTaq® recomienda una temperatura de extensión de 68 °C; pruebe con 65 °C. Aumente la temperatura de hibridación. Pruebe protocolos de ciclado de 2 pasos. Si, además de la mancha, se observa un halo iluminado alrededor del pocillo, use menos plantilla. P: ¿Qué extremos tendrán mis productos de PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA DE APLICACIÓN PRODUCTO PCR EXTREMOS PCR de alta fidelidad Polimerasas Q5® Blunt Polimerasas Phusion® Blunt PCR de rutina y especial Polimerasas OneTaq® 3'A/blunt Polimerasas Taq 3'A Polimerasas LongAmp® 3'A/blunt Hemo KlenTaq Polimerasa 3'A Amplificación isotérmica Polimerasas Bst 3'A Polimerasa Bsu 3'A Polimerasa phi29 Blunt Manipulación de ADN Polimerasa de ADN T7 Blunt ADN polimerasa I de E. coli Blunt ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow) Fragmento Klenow romo (3'-5' exo-) 3'A Polimerasa de ADN T4 Blunt Vent® Polimerasa Blunt Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Polimerasa Deep Vent® Blunt Deep Vent® (exo-) Polimerasa 3'A Para más información Para obtener más información sobre nuestras polimerasas, incluidas las actividades y aplicaciones de las exonucleasas, visite nuestra Tabla de selección de ADN polimerasa. Más información Para obtener más información sobre la actividad de las exonucleasas, consulte estas preguntas frecuentes. ¿Por qué algunas polimerasas se embotan y otras añaden un nucleótido? Las polimerasas que poseen actividad de corrección (exonucleasa 3'-5'), como Q5, Phusion y Deep Vent, añadirán un nucleótido sin plantilla a los extremos 3' de los fragmentos de ADN extendidos, pero la actividad de la exonucleasa lo elimina posteriormente. Otras polimerasas que carecen de actividad de exonucleasa 3'-5' (como Taq y las polimerasas basadas en Taq) añadirán un nucleótido adicional a los extremos 3' (predominantemente, pero no exclusivamente, dA) y dejarán intacto el saliente sin plantilla. Por eso es importante saber qué polimerasa utilizar al realizar la clonación de extremos romos o T/A. Las ADN polimerasas OneTaq y LongAmp Taq son mezclas optimizadas de las ADN polimerasas Taq (una polimerasa de la Familia A) y Deep Vent (una polimerasa de la Familia B). La actividad polimerasa intrínseca de Taq añade un extremo 3'A sin plantilla, mientras que la actividad exonucleasa 3'–5' de Deep Vent aumenta la fidelidad y robustez de Taq, pero también opaca los productos de PCR. Es por esto que estos productos producen una mezcla de extremos de ADN. Sin embargo, la mayoría de los extremos tendrán un saliente 3'A. P: ¿Qué significa la actividad exonucleasa para una ADN polimerasa? R: Las polimerasas pueden poseer hasta dos tipos de actividad exonucleasa: la actividad exonucleasa 5'- 3' digerirá los nucleótidos en la dirección 5' a 3' en una plantilla antes de la actividad polimerasa. La Taq polimerasa posee un tipo específico de actividad exonucleasa 5'-3' llamada actividad endonucleasa de colgajo 5', que cataliza la escisión de los colgajos de ADN 5' de un dúplex de ADN que tiene un saliente 5' monocatenario en una de las cadenas. La actividad exonucleasa 3' - 5', también conocida como actividad de corrección, digiere nucleótidos con grupos hidroxilo 3' de la dirección 3' a 5'. Esto incluye la corrección de pares de bases desapareados y la digestión terminal 3'. Algunas polimerasas poseen uno o ambos tipos de estos tipos de actividades exonucleasas. En presencia de dNTP, la actividad de polimerización es mayor que la actividad exonucleasa. Algunas polimerasas no poseen ninguna de estas actividades. Más información ¿Qué significa cuando una polimerasa tiene actividad exonucleasa 5'- 3'? Cuando las polimerasas con actividad de exonucleasa 5'- 3' encuentran un nucleótido corriente abajo en la misma cadena, los enlaces fosfodiéster de la cadena encontrada se hidrolizan (digieren) antes de la polimerización. La Taq polimerasa posee un tipo específico de actividad de exonucleasa 5'- 3' llamada actividad de endonucleasa de colgajo 5', que cataliza la escisión de los colgajos de ADN 5' de un dúplex de ADN que tiene un saliente 5' monocatenario en una de las cadenas. Cuando la Taq polimerasa encuentra una estructura de colgajo de este tipo, como el fluoróforo en una sonda de hidrólisis de qPCR, digiere secuencialmente los enlaces fosfodiéster entre nucleótidos en la dirección 5'- 3' antes de la polimerización. La relación entre la actividad de exonucleasa 3' - 5' (corrección) y la longitud del producto de PCR. Las ADN polimerasas garantizan una replicación precisa mediante una serie de puntos de control molecular en el sitio de incorporación de nucleótidos y más allá. Durante la adición de nucleótidos, el nucleótido entrante correcto se posiciona para una alineación productiva de los grupos catalíticos, lo que garantiza una incorporación eficiente. Esta alineación para la catálisis es sensible a las distorsiones en la posición causadas por un apareamiento de bases Watson-Crick incorrecto, lo que permite el estancamiento cinético en pares de bases incorrectos o no cognados. Las polimerasas con actividad de corrección de errores "verifican" si se ha insertado o no el nucleótido correcto en la plantilla. Si se detecta un desajuste, el ADN se transfiere del dominio de polimerización al dominio exonucleasa 3'-5' N-terminal de la polimerasa. El nucleótido incorporado incorrectamente se escinde, el ADN regresa al dominio de polimerización y se puede reanudar la copia. La ausencia de actividad exonucleasa 3'-5' (corrección de errores) puede tener ramificaciones más allá de la fidelidad en la PCR. Se ha propuesto que la falta de actividad de corrección de pruebas en la Taq ADN polimerasa limita el tamaño máximo posible del amplicón. Generalmente, Taq funciona mejor al amplificar fragmentos de ADN < 2 kb, pero puede funcionar con fragmentos de hasta 3-4 kb. Cuando se mantiene a este tamaño de amplicón, Taq es una enzima robusta y fácilmente optimizada. Sin embargo, con productos por encima de ~3 kb, su efectividad disminuye rápidamente. Durante la PCR, Taq incorporará nucleótidos incorrectamente y producirá desajustes, lo que la hace propensa al estancamiento y más propensa a disociarse antes de extender el producto de longitud completa. La combinación de un cierto tamaño de amplicón y la tasa de error de la polimerasa puede resultar en la acumulación de suficientes extremos 3' desapareados para inhibir eficazmente el proceso de PCR. Estos extremos 3' desapareados son particularmente problemáticos para Taq porque carece de la actividad exonucleasa 3'→ 5' para eliminarlos. Al mezclar una pequeña cantidad de una polimerasa con actividad exonucleasa correctora, como la ADN polimerasa Deep Vent®, se puede lograr la amplificación de fragmentos ≥ 20 kb (ver ADN polimerasa LongAmp®). Dado que la gran mayoría de la enzima en la mezcla es Taq ADN polimerasa, probablemente esté realizando la mayor parte de la extensión del cebador, con la ADN polimerasa correctora Deep Vent eliminando los desajustes inhibidores 3' generados por Taq. Para aprender más sobre la anatomía de una polimerasa y cómo la estructura se relaciona con la función, vea este artículo destacado. ¿Cómo bloquear la actividad exonucleasa durante la PCR? Añada enlaces fosforotioato a los cebadores. Un enlace fosforotioato (pt) es un enlace fosfodiéster donde uno de los dos oxígenos no puente ha sido reemplazado por un átomo de azufre, lo que inhibe la actividad fosfodiesterasa de la nucleasa. Químicamente, la sustitución de oxígeno por azufre no altera drásticamente la reactividad del enlace, y los polinucleótidos que contienen pt pueden seguir funcionando en muchas reacciones enzimáticas. En la mayoría de los contextos, los enlaces 2-3 pt en el extremo 3' son suficientes para bloquear la actividad de la polimerasa 3'-5' exonucleasa. P: ¿La ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® exhibe actividad de desplazamiento de cadena? R: No. La ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (y todas las formulaciones de productos Q5) tiene una tendencia extremadamente baja a desplazar los nucleótidos posteriores en la cadena no molde. Para ver más características de nuestras polimerasas, consulte la Tabla de selección de ADN polimerasas. P: ¿Cuáles son las propiedades de esta polimerasa (fidelidad, extremos del producto, máximo amplicón, incorporación de bases modificadas, etc.)? A: FIDELIDAD DE LOS PRODUCTOS DE POLIMERASA* TASA DE ERROR EXTREMOS DEL PRODUCTO LONGITUD MÁXIMA DEL PRODUCTO** TEMPERATURA DE EXTENSIÓN INCORPORACIÓN DE NUCLEÓTIDOS MODIFICADOS*** INCORPORACIÓN DE URACILO 5´-3´ EXONUCLEASE 3´-5´ (CORRECCIÓN DE PRUEBAS) EXONUCLEASE Q5 Polimerasas 280X <0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC, 6 mA No (excepto Q5U) - ++++ Phusion Polimerasas 39-50X 0,44 x 10-6 Blunt 20 kb simple, 10 kb complejo 72 °C 5 mC, 5 hmC No - ++++ OneTaq Polimerasas 2X <140 x 10-6 3´A/romo 6 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + ++ Taq Polimerasas 1X 2,85 x 10^-4 3´A 5 kb 68 °C 5 mC, 5 hmC, biotina, DIG Sí + - Hemo KlenTaq nt nt 3´A 2 kb 68 °C Sí No - LongAmp® Polimerasas 2X 3´A/romo 30 kb 65 °C No Sí ++ *Fidelidad relativa a la ADN polimerasa Taq. Seguimos investigando ensayos para caracterizar la tasa de error muy baja de Q5 para garantizar que presentamos los datos de fidelidad más precisos posibles (Potapov, V y Ong, JL (2017) PloS ONE, 12(1): e0169774). **Las plantillas simples incluyen ADN genómico plasmídico, viral y de E. coli. Las plantillas complejas incluyen ADN genómico y ADNc de plantas, humanos y otros mamíferos. *** Para más información, contacte con el Soporte Técnico en info@neb.com. Para más información sobre las propiedades que le ayudarán a seleccionar una polimerasa para su aplicación, consulte nuestra Tabla de Selección de ADN Polimerasas. Más información Fidelidad y tasa de error. La fidelidad de una ADN polimerasa se define por su capacidad para replicar con precisión una plantilla, mientras que la tasa de error es la tasa de incorporación incorrecta de un nucleótido con coincidencia incorrecta. La fidelidad es importante para aplicaciones en las que la secuencia de ADN debe ser correcta después de la amplificación. Para más información sobre cómo se mide la fidelidad, haga clic aquí. Extremos de producto y actividad de exonucleasa. Consulte la sección "Más información" en nuestras Preguntas frecuentes sobre extremos de producto de PCR y nuestras Preguntas frecuentes sobre la actividad de exonucleasa para ADN polimerasas. P: ¿Cuál debería ser la concentración final del cebador en mi PCR? A: PRODUCTOS DE POLIMERASA CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR RECOMENDADA (CADA UNO) RANGO DE CONCENTRACIÓN FINAL DE CEBADOR (CADA UNO) Polimerasas Q5® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas Phusion® 500 nM 200-1000 nM Polimerasas OneTaq® 200 nM 50-1000 nM Polimerasas Taq 200 nM 50-1000 nM Hemo KlenTaq 300 nM 50-1000 nM Polimerasas LongAmp® 400 nM 50-1000 nM Recomendamos una concentración final de cebador de 500 nM cuando se utilizan polimerasas Q5 y ​​Phusion debido a su alta actividad de exonucleasa 3´-5´. Recomendamos una concentración final de cebador de 200 nM al utilizar polimerasas basadas en Taq, como OneTaq y EpiMark®. Consulte los protocolos específicos en las páginas de los productos para obtener información sobre las recomendaciones de rango. Más información Las polimerasas de la familia B de Archaeal, como Q5 y ​​Phusion, poseen una fuerte actividad exonucleasa 3'-5', que puede digerir nucleótidos en el extremo 3' de los cebadores y aumentar la probabilidad de amplificación inespecífica. En comparación con las polimerasas de la familia A, como Taq y OneTaq, una mayor concentración final de cebador compensa estos efectos y promueve la formación de productos específicos. Generalmente, una PCR eficiente requiere proporciones óptimas de magnesio, otros iones y cebadores para promover la especificidad mediante la estabilización de las cargas negativas en la cadena principal de fosfato. Si bien la composición de las ADN polimerasas Q5 y ​​Phusion es exclusiva, sus tampones están optimizados para usar una concentración final de cebador de 500 nM. P: ¿Cuándo y cómo debo usar el potenciador de alta GC Q5®? R: El potenciador Q5 High GC es un aditivo que debe utilizarse al trabajar con plantillas particularmente difíciles o con alto contenido de GC, pero puede ser inhibidor al utilizar plantillas con alto contenido de AT. La enzima Q5 independiente puede cubrir un rango más amplio de contenido de GC (hasta un 80 %) con la adición del potenciador de GC. El potenciador Q5 High GC es un reactivo complementario a las formulaciones de la enzima Q5 y ​​el tampón (M0491 y M0493) y no debe utilizarse solo. *Este potenciador no es un tampón independiente y no debe utilizarse solo. Además, no debe añadirse a ninguna mezcla maestra Q5 (M0492, M0494, M0500, E0555). Q5U no se beneficia del potenciador Q5 High GC y no recomendamos su uso. La adición de aditivos comunes para PCR, como hasta un 2 % de DMSO, puede mejorar la amplificación de ciertas dianas difíciles o largas. A menudo no es necesario alterar la temperatura de annealing de su reacción después de agregar Q5 High GC Enhancer. Recomendamos usar nuestra calculadora de Tm para determinar la temperatura de annealing de su PCR. Más información El uso de Q5 High GC Enhancer a menudo reduce el rango efectivo de temperaturas en el que se puede observar la amplificación específica al reducir las estructuras secundarias complejas de la plantilla, lo que puede aumentar la amplificación de su ADN objetivo y mejorar su rendimiento de productos difíciles de amplificar, como las plantillas ricas en GC. Generalmente, los aditivos de PCR suelen funcionar de una de dos maneras: Reduciendo las estructuras secundarias del ADN, lo que aumenta la amplificación de su ADN objetivo Las estructuras secundarias del ADN pueden desestabilizarse por aditivos que se unen a los surcos menores y mayores del ADN y afectando los enlaces de hidrógeno del dúplex. Las estructuras secundarias incluyen la doble hélice (mayor enlace de hidrógeno debido al mayor contenido de GC) y las estructuras de tallo-bucle (horquillas o nucleótidos abultados que reducen la hibridación) Reduciendo el cebado no específico y, por lo tanto, reduciendo la amplificación del ADN fuera del objetivo. P: ¿Funcionan otras polimerasas en el tampón de reacción Q5®? R: El tampón de reacción Q5 ha sido formulado específicamente para su uso con las ADN polimerasas Q5 y ​​Q5 Hot Start de alta fidelidad. Las ADN polimerasas Phusion y Taq (y productos relacionados) muestran resultados más consistentes en sus respectivos tampones. P: ¿Hay un precipitado en el fondo del tubo de mezcla maestra? ¿Es esto normal? R: La mezcla maestra Q5® puede precipitar al congelarla y descongelarla. Esto no indica un problema con el producto. Para un rendimiento óptimo, descongélela completamente y resuspenda cualquier precipitado calentándola a temperatura ambiente e invirtiéndola suavemente hasta que se disuelva por completo. P: ¿Qué son las polimerasas Hot Start y WarmStart® y cuándo debo usarlas? R: Al configurar reacciones a temperatura ambiente fuera del hielo Cuando se observa una amplificación no específica ¿Qué significa Hot Start/Walk Start? Nuestras polimerasas Hot Start y WarmStart utilizan aptámeros que inhiben la actividad enzimática a temperatura ambiente, lo que desalienta la formación de productos no específicos. La presencia de estos aptámeros no altera la función enzimática central. La diferencia entre Hot Start y WarmStart radica en que las enzimas Hot Start son termófilas, mientras que las WarmStart® son mesófilas; el rango termodinámico de los aptámeros para las enzimas Hot Start y WarmStart es en gran medida similar. Los aptámeros son oligonucleótidos modificados que se unen a una molécula diana específica mediante interacciones no covalentes e incluyen modificaciones específicas de nucleobases que pueden mejorar los perfiles de inhibición o reducir los efectos secundarios no deseados. La ventaja de la inhibición basada en aptámeros sobre otras tecnologías Hot Start (como los anticuerpos) es que no requieren un paso de activación y se unen de forma reversible, dependiente de la temperatura. NEB ofrece polimerasas con aptámeros para PCR de rutina, PCR de alta fidelidad, amplificación isotérmica y transcripción inversa. Estos aptámeros pueden dirigirse a diferentes funciones enzimáticas para diferentes polimerasas. Más información. ¿Por qué se llama "Hot Start"? Al igual que muchas ADN polimerasas de la Familia A que no realizan corrección de errores, la Taq Polimerasa posee la capacidad de añadir bases al extremo del ADNmc de forma independiente del molde, incluso a temperatura ambiente, y puede provocar la adición de bases no específicas a los extremos de los cebadores de ADN en la reacción, lo que permite la hibridación inespecífica y reduce la especificidad general de la reacción. Por el contrario, a temperaturas más altas, la unión no específica se reduce a medida que la hibridación se vuelve más rigurosa. Los primeros métodos para mitigar la actividad no deseada a baja temperatura se centraban en la exclusión de componentes clave de la reacción hasta que se aumentaba la temperatura de reacción, lo que permitía añadirlos a la mezcla, desencadenando la reacción en condiciones más restrictivas y de alta temperatura. Lea nuestro artículo destacado, "Uso de aptámeros para controlar la actividad enzimática. Inicio rápido de Taq y más allá", para ver datos que comparan la formación de producto para enzimas con y sin inhibición de la actividad basada en aptámeros. P: Hay un precipitado en el fondo del tubo de tampón. ¿Es normal? R: El tampón de reacción Q5® puede precipitar al congelar y descongelar. Esto no indica un problema con el producto. Para un rendimiento óptimo, descongele completamente y resuspenda cualquier precipitado calentándolo a temperatura ambiente e invirtiéndolo suavemente hasta que se disuelva por completo.